流感病毒感染對慢性阻塞性肺疾病患者氧化應(yīng)激和全身炎性反應(yīng)的影響

盧文宣 張明泳 韓 偉 唐華平 (青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院東院呼吸科，山東 青島 266071)

越來越多的證據(jù)顯示慢性阻塞性肺病急性加重(Acute Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary Disease，AECOPD)與病毒性呼吸道感染有關(guān)［1］。由于經(jīng)常變異，即便常見的呼吸道病毒也可能引發(fā)嚴(yán)重的肺部病變，甚至死亡。阻斷病毒損傷的關(guān)鍵步驟是目前治療嚴(yán)重病毒感染的重要策略。本研究調(diào)查流感病毒感染AECOPD患者的氣道氧化應(yīng)激改變及其與病情的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取2011年10月1日～2012年10月1日連續(xù)就診青島市市立醫(yī)院東院呼吸科就診的可疑病毒感染的中度AECOPD患者200例，其中男142例，女58例，年齡52～86歲，平均(73.90±9.83)歲，病程3～40年。COPD和AECOPD診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2003版GOLD指南［2］?；颊咭来芜M(jìn)行血常規(guī)、血內(nèi)毒素(BET)、痰培養(yǎng)、胸部X線和肺功能檢查。同時(shí)符合以下條件者可入選研究:①無膿性痰;②血液白細(xì)胞＜10×109/L;③內(nèi)毒素(BET)正常;④痰細(xì)菌培養(yǎng)陰性;⑤X線檢查排除肺內(nèi)其他病變;⑥肺功能檢查(MedGraphic肺功能儀，美國):支氣管舒張?jiān)囼?yàn)陰性，F(xiàn)EV1/FVC＜70%，支氣管舒張劑前60%＜FEV1% ＜80%。另外選擇20例中度COPD穩(wěn)定期患者作為對照組。

1.2 呼吸道分泌物采集與處理:參考文獻(xiàn)［3］。在就診當(dāng)日留取痰標(biāo)本。加入等體積含0.1%DTT的PBS液中震蕩2 min，37℃水浴15 min，1 500 r/min低速離心取上清液，置-20℃保存。

1.3 呼吸分泌物病毒測定:根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫中流感病毒核苷酸序列，參照相關(guān)文獻(xiàn)［4］，用Primer express 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，流感病毒A引物序列如下:F:5'-GACCRATCCTGT-CACCTCTGAC-3';R:5'-GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3'產(chǎn)物長度:108 bp。以RNase P作內(nèi)參:F:5'-AGATTTGGACCTGCGAGCGR-3':5'-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3'。反應(yīng)體系總體積為 25 μl，具體如下:10×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP Mix 2.5 μl，上游引物、下游引物各 1 μl，DNA Polymerase 0.2 μl，模板 DNA 1 μl，加 水補(bǔ)足至 25 μl。反應(yīng)參數(shù):95℃ 10 min ，95℃ 15 s，55℃ 31 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，每次擴(kuò)增均設(shè)立陽性對照和陰性對照。上述RTPCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察。采用美國Gene Genius凝膠電泳成像系統(tǒng)測出目的基因和內(nèi)參的表達(dá)強(qiáng)度，計(jì)算校正后目的基因表達(dá)強(qiáng)度(目的基因表達(dá)強(qiáng)度/內(nèi)參表達(dá)強(qiáng)度)。

1.4 呼吸道氧化應(yīng)激因子測定:取痰上清液，按參考文獻(xiàn)［3］，分別以WST-1法測定超氧化物岐化酶(SOD)和硫代巴比妥法測定脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)。SOD檢測試劑盒和MDA檢測試劑盒由南京建成生物有限公司提供。

1.5 血漿炎性因子測定:取患者空腹血3 ml放于抗凝管中，靜置30 min后離心取血漿。以IL-6和IL-8 ELISA試劑盒(R＆D)按說明書步驟測定IL-6和IL-8等炎性相關(guān)因子水平。

2 結(jié)果

2.1 患者分組和一般情況:共有25例患者痰液檢出流感病毒，劃入流感組。流感組和對照組在性別、年齡、吸煙史、COPD病史方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 兩組患者一般情況對比

2.2 兩組痰液中SOD和MDA水平比較:兩組患者痰中SOD、MDA水平見表2。統(tǒng)計(jì)顯示，流感組的MDA高于對照組，而流感組的SOD低于對照組，組間差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。

2.3 兩組血漿炎性因子比較:兩組患者血漿IL-6和IL-8水平見表3。統(tǒng)計(jì)顯示，流感組的IL-6和IL-8水平高于對照組，組間差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。值得注意的是，流感組IL-8水平與MDA水平成正相關(guān)(r=0.463，P=0.020)，見圖1。

2.4 病毒表達(dá)強(qiáng)度與痰液氧化應(yīng)激水平的關(guān)系:流感組流感病毒的校正后平均表達(dá)強(qiáng)度為0.66±0.07，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在流感組內(nèi)，流感病毒表達(dá)強(qiáng)度與痰MDA成正相關(guān)(r=0.557，P﹤0.05，圖2)，提示流感病毒感染與氣道氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)有關(guān)。

表2 兩組患者痰MDA、SOD的水平(±s)

表2 兩組患者痰MDA、SOD的水平(±s)

注:與對照組比較，①P＜0.05

組別 例數(shù) MDA(nmol/ml) SOD(U/ml)流感組 25 6.64±1.22① 58.47±6.79①對照組 20 3.43±1.24 65.47±10.25 t值 2.22 2.75 P值 ﹤0.05 ﹤0.05

表3 兩組患者IL-6和IL-8的水平(±s)

表3 兩組患者IL-6和IL-8的水平(±s)

注:與對照組比較，①P＜0.05

組別 例數(shù) IL-6(pg/ml) IL-8(ng/ml)流感組 25 67.89±15.8① 5.81±1.09①對照組 20 42.17±10.4 3.43±1.25 t值 6.27 3.95 P值 ﹤0.05 ﹤0.05

圖1 流感組IL-8與MDA的相關(guān)性:r=0.463，P=0.020

圖2 流感病毒表達(dá)強(qiáng)度與痰MDA的相關(guān)性:r=0.557，P﹤0.05

3 討論

越來越多的研究顯示，呼吸道病毒感染是引起AECOPD的重要因素。與沒有病毒參與的AECOPD相比，伴有病毒感染AECOPD患者的臨床癥狀評分更高，痰和血液中的炎性因子水平更高，中位恢復(fù)時(shí)間更長，發(fā)作頻率也更頻繁［1，5］。本研究系統(tǒng)探討了流感病毒對AECOPD患者氧化應(yīng)激和氣道炎癥的影響。

作為COPD發(fā)病的重要病理生理機(jī)制，氧化/抗氧化失衡一直是COPD研究的重要方向［6］。MDA是氧化過程的終產(chǎn)物，具有強(qiáng)氧化性，可損害機(jī)體的組織和細(xì)胞，進(jìn)而引起慢性疾病及衰老效應(yīng);而SOD能催化O-2發(fā)生歧化反應(yīng)，以清除氧自由基，保護(hù)肺臟免受氧化損傷。二者可間接反應(yīng)自由基代謝水平。本研究發(fā)現(xiàn)，和其他病因所致AECOPD一樣，流感病毒致AECOPD患者氣道內(nèi)也存在氧化應(yīng)激增強(qiáng)，表現(xiàn)為痰液MDA水平升高，而SOD明顯降低(P＜0.01)。而且流感病毒感染者M(jìn)DA水平與流感病毒轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度成正相關(guān)(r=0.557，P﹤0.05)，提示流感病毒復(fù)制在COPD患者氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用［7］。糾正氧化/抗氧化失衡可能成為對抗流感病毒誘發(fā)AECOPD的重要方法。Yamada等早期研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用抗氧化劑可保護(hù)小鼠抵抗致死劑量流感病毒A的危害［8］。但限于藥物發(fā)展以及氧化/抗氧化平衡在機(jī)體的重要作用，尚無成熟的強(qiáng)效抗氧化劑應(yīng)用于重癥流感病毒的臨床工作。進(jìn)一步闡明流感病毒與氧化應(yīng)激反應(yīng)的內(nèi)在聯(lián)系，以及抗氧化治療的機(jī)制是目前亟待解決的難題。最近研究發(fā)現(xiàn)抗氧化劑乙酰半胱胺酸能夠抑制Ⅱ型上皮細(xì)胞的粘蛋白合成和促炎介質(zhì)釋放［9］。而Yageta等發(fā)現(xiàn)抗氧化因子Nrf2參與了吸煙小鼠對流感病毒感染的抵抗，再次證實(shí)氧化應(yīng)激在流感病毒感染中發(fā)揮重要作用［10］。

IL-6和IL-8是兩種重要的COPD促炎性反應(yīng)因子，具有活化中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，促進(jìn)免疫蛋白分泌，推進(jìn)炎性反應(yīng)過程發(fā)展的作用，除有助于殺傷病原微生物及控制感染，二者的持續(xù)升高還參與了氧化應(yīng)激過程。IL-6能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞的氧化反應(yīng)，延緩中性粒細(xì)胞凋亡，釋放更多超氧陰離子，加重氧化應(yīng)激反應(yīng)。IL-8能夠吸引炎性細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞到達(dá)炎性反應(yīng)部位，并誘導(dǎo)其脫顆粒作用，釋放大量氧自由基、組胺、花生四烯酸等系列炎性癥介質(zhì)，加重氣道氧化應(yīng)激炎性反應(yīng)。和以往研究一致，本研究流感組COPD患者血清IL-8和IL-6水平均顯著高于對照組(P＜0.05)，且本研究發(fā)現(xiàn)，流感組血清IL-8水平與氣道MDA呈正相關(guān)(r=0.463，P=0.020)。這一結(jié)果進(jìn)一步證明，在AECOPD氣道氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的同時(shí)存在全身炎性反應(yīng)增強(qiáng)［11］。

綜上所述，流感病毒感染與氧化應(yīng)激間存在密切的聯(lián)系，對于COPD患者在流感早期應(yīng)用抗氧化應(yīng)激的藥物，可能緩解病情，改善患者預(yù)后，降低患者住院率和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。有關(guān)闡明流感病毒參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)制，以及抗氧化治療的作用，尚需進(jìn)一步研究和評價(jià)。

［1］ Varkey JB，Varkey B.Viral infections in patients with chronic obstructive pulmonary disease［J］.Cur Opinion Pulm Med，2008，14(2):89.

［2］ Global Strategy for the Diagnosis，Management and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease(update2010).Available from:http://www.goldcopd.org/Guidelines/guideline-2010-gold-report.html.

［3］ 劉凌云，曾 勉，謝燦茂，等.慢性阻塞性肺病患者氧化應(yīng)激狀態(tài)及其與糖皮質(zhì)激素受體水平的相關(guān)性［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28(6):992.

［4］ Rohde G，Wiethege A，Borg I，et al.Respiratory viruses in exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease requiring hospitalization:a case-control study［J］.Thorax，2003，58(1):37.

［5］ Gorse GJ，O'connor TZ，Young SL，et al.Impact of a winter respiratory virus season on patients with COPD and association with influenza vaccination［J］.Chest，2006，130(4):1109.

［6］ Inonu H，Doruk S，Sahin S，et al.Oxidative stress levels in exhaled breath condensate associated with COPD and smoking［J］.Respir Care，2012，57(3):413.

［7］ Yamada Y，Limmon GV，Zheng D，et al.Major shifts in the spatio-temporal distribution of lung antioxidant enzymes during influenza pneumonia［J］.Plos One，2012，7(2):e31494.

［8］ Yatmaz S，Seow HJ，Gualano RC，et al.Glutathione Peroxidase-1(GPx-1)reduces influenza A virus-induced lung inflammation，2012.

［9］ Mata M，Morcillo E，Gimeno C，et al.N-acetyl-L-cysteine(NAC)inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus(RSV)［J］.Biochem Pharmacol，2011，82(5):548.

［10］ Yageta Y，Ishii Y，Morishima Y，et al.Role of Nrf2 in host defense against influenza virus in cigarette smoke-exposed mice［J］.J Virol，2011，85(10):4679.

［11］ 國 家，丁 會，華樹成.慢性阻塞性肺疾病的治療進(jìn)展［J］. 吉林醫(yī)學(xué)，2010，31(4):539.