液相芯片與免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌ERCC1和RRM1表達(dá)的比較研究

胡艷正 王 偉 尚立群 李學(xué)昌 文 鋒 李 軍劉軍強(qiáng)

液相芯片與免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌ERCC1和RRM1表達(dá)的比較研究

胡艷正①②王 偉②尚立群②李學(xué)昌②文 鋒②李 軍②劉軍強(qiáng)②

目的：切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（exsicion repair cross-complementing group 1，ERCC1）和核糖核苷酸還原酶M1（ribonucleotide reductase M1，RRM1）的表達(dá)水平可預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）對(duì)化療的敏感性。旨在評(píng)價(jià)免疫組織化學(xué)檢測(cè)的蛋白水平與液相芯片檢測(cè)的mRNA水平的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法：采用免疫組織化學(xué)和液相芯片方法分別檢測(cè)42例非小細(xì)胞肺癌組織中ERCC1、RRM1的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)水平，非參數(shù)相關(guān)性分析二者表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果：兩種方法檢測(cè)的非小細(xì)胞肺癌組織中ERCC1和RRM1蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)的一致率分別為52.3%（22/42）和76.2%（32/42）；兩種方法檢測(cè)RRM1和ERCC1蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.778，P=0.010；r=0.277，P=0.076）。結(jié)論：免疫組織化學(xué)檢測(cè)的RRM1和ERCC1的蛋白水平與液相芯片檢測(cè)的mRNA水平具有較好的一致性和相關(guān)性，二種方法同時(shí)檢測(cè)可以增加臨床應(yīng)用的敏感性和特異性。

非小細(xì)胞肺癌 切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1 核糖核苷酸還原酶M1 免疫組織化學(xué) 液相芯片

肺癌是目前全球范圍內(nèi)死亡率最高的惡性腫瘤，全球每年新增病例達(dá)120萬例，其中病理學(xué)確診的肺癌中約有80%為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）［1］。化療是NSCLC的主要治療方法，鉑類和20世紀(jì)90年代以后的三代新藥（吉西他濱、培美曲塞、紫杉醇等）為NSCLC公認(rèn)的化療藥物。鉑類抗癌作用的主要靶點(diǎn)為DNA，通過DNA-Pt-DNA結(jié)構(gòu)形成DNA鏈內(nèi)交聯(lián)、鏈間交聯(lián)或通過DNA-Pt-蛋白質(zhì)形成DNA-蛋白交聯(lián)，破壞DNA的正常結(jié)構(gòu)，阻礙DNA的模板作用，進(jìn)而抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，使增殖迅速的細(xì)胞停滯在G2/M期［2］。ERCC1過表達(dá)可使停滯在G2/M期損傷的DNA迅速修復(fù)，導(dǎo)致其對(duì)鉑類耐藥。吉西他濱是嘧啶類抗代謝藥，作用于DNA合成期，通過干擾（RRM1）的功能而減少脫氧核苷酸的產(chǎn)生，最終影響DNA合成，RRM1過表達(dá)可導(dǎo)致其耐藥［3］。由于不同個(gè)體腫瘤組織ERCC1和RRM1的表達(dá)不同，導(dǎo)致對(duì)吉西他濱和鉑類藥物的敏感性不同。檢測(cè)腫瘤組織中ERCC1和RRM1表達(dá)可預(yù)測(cè)患者對(duì)GP（吉西他濱+鉑類）化療方案的敏感性，從而指導(dǎo)臨床實(shí)施個(gè)體化化療，避免耐藥患者接受不必要的不良反應(yīng)，提高治療療效，改善患者預(yù)后。

免疫組織化學(xué)檢測(cè)ERCC1和RRM1的蛋白水平是目前臨床常用的檢測(cè)方法，近年來，液相芯片技術(shù)的發(fā)展及其多通路、高通量和實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析等優(yōu)點(diǎn)使其在檢測(cè)基因mRNA水平具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究分別采用免疫組織化學(xué)技術(shù)及液相芯片技術(shù)檢測(cè)NSCLC患者原發(fā)癌組織標(biāo)本中ERCC1和RRM1的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)二者的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

2011年4月至2012年6月行手術(shù)切除且病理證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌的42例患者，男性29例、女性13例；年齡39～77歲，中位年齡57歲；鱗癌25例，腺癌15例，其他2例；病理分期Ⅰ期22例，Ⅱ期14例，Ⅲ期6例。所有患者術(shù)前均未接受任何針對(duì)腫瘤的治療措施。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ERCC1和RRM1的蛋白表達(dá)

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm切片，常規(guī)HE染色。免疫組織化學(xué)染色采用EnVision二步法，高溫高壓抗原修復(fù)，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，一抗室溫2 h，二抗室溫20 min，DAB顯色，流水沖洗，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水透明后中性樹膠封片。已知陽性切片作為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。鼠抗人ERCC1單克隆抗體（ab2356）和鼠抗人RRM1單克隆抗體（ab81085）為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品（1：100稀釋），羊抗鼠/兔二抗檢測(cè)試劑盒購自上海太陽生物技術(shù)有限公司，一抗稀釋液及DAB顯色試劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2.2 結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)陽性染色呈棕黃色顆粒，ERCC1定位于腫瘤細(xì)胞核，RRM1定位于細(xì)胞質(zhì)。依據(jù)Olaussen等［4］的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)染色程度和染色陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分。Olympus光學(xué)顯微鏡高倍鏡下（×400）隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)細(xì)胞，以見到腫瘤細(xì)胞胞核或胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)細(xì)胞染色程度和染色陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分。染色程度：基本不著色記0分，稀疏的棕色顆粒記1分，較多的棕黃色顆粒記2分，彌漫粗大的棕黃色顆粒記3分。將染色程度分級(jí)與著色陽性細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分比相乘得出H值（與下面的內(nèi)容合并）。染色程度：基本不著色0分，稀疏的棕色顆粒1分，較多的棕黃色顆粒2分，彌漫粗大的棕黃色顆粒3分。將染色程度分級(jí)與著色陽性細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分比相乘得出H值。H值為0分為陰性（-）；0＜H值＜l為弱陽性（+），1≤H值＜2為中度陽性（++），2≤H值＜3為強(qiáng)陽性（+++）（圖1，2）。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NSLC組織中ERCC1蛋白表達(dá)（×400）Figure 1 ERCC1 expression tested by immunohistochemistry

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NSLC組織中RRM1蛋白表達(dá)（×400）Figure 2 RRM1 expression tested by immunohistochemistry

1.3 液相芯片法檢測(cè)ERCC1和RRM1 mRNA表達(dá)

液相芯片檢測(cè)：組織標(biāo)本經(jīng)75%乙醇固定，取適量樣本加入裂解液（廣州益善公司提供），56℃下裂解反應(yīng)2 h，將組織裂解液轉(zhuǎn)移至孵育板上，加入支持探針-微球、支持延伸探針、緩沖液，55℃震蕩孵育過夜，次日將孵育板放在磁力架上1 min，加入洗滌液，震蕩洗滌1 min，孵育板放在磁力架上1 min，棄去上清，重復(fù)3次，加入擴(kuò)增延伸探針和標(biāo)記探針，50℃震蕩反應(yīng)1 h，孵育板放在磁力架上1 min，棄去上清；洗滌液洗2次，加入鏈霉親和素-藻紅蛋白，50°震蕩反應(yīng)30 min，孵育板放在磁力架上1 min，吸取棄去上清；洗滌液洗2次，加入洗滌液，震蕩5 min，待測(cè)物如ERCC1mRNA或RRM1mRNA在液相反應(yīng)體系中與分子探針特異性結(jié)合后加入熒光標(biāo)記，經(jīng)液相懸浮反應(yīng)后的乳膠顆粒被微量液體傳送系統(tǒng)排成單列通過兩束激光：一束判定顆粒的顏色從而決定被測(cè)物的性質(zhì)（定性），另一束測(cè)定微粒上熒光標(biāo)記強(qiáng)度從而決定被測(cè)物的量（定量）。所得到數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理后可直接用來判定結(jié)果。

Luminex閱讀儀顯示為液相芯片微球中位熒光讀數(shù)，經(jīng)廣州益善生物有限公司提供數(shù)據(jù)處理軟件產(chǎn)生最終結(jié)果，根據(jù)ERCC1和RRM1表達(dá)水平依次分為低表達(dá)、中偏低表達(dá)、中表達(dá)、中偏高表達(dá)、高表達(dá)（表達(dá)程度判定參考益善檢測(cè)人群數(shù)據(jù)庫）（圖3，4）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。免疫組織化學(xué)與液相芯片方法檢測(cè)的腫瘤組織中ERCC1、RRM1表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖3 液相芯片法測(cè)定ERCC1表達(dá)，樣本ERCC1中偏低表達(dá)Figure 3 ERCC1 expression tested by a suspension biochip；the figure shows an expression level that is less moderate

圖4 液相芯片法測(cè)定RRM1表達(dá)，樣本中RRM1中低表達(dá)Figure 4 RRM1 expression tested by a suspension biochip；the figure shows an expression level that is less moderate

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)NSCLC組織中ERCC1和RRM1蛋白表達(dá)

經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測(cè)的42例組織樣本中，ERCC1表達(dá)結(jié)果為（-）30例，（+）8例，（++）3例，（+++）1例；RRM1表達(dá)結(jié)果為（-）7例，（+）26例，（++）4例，（+++）5例（表1）。

表1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)NSCLL組織中ERCC1、RRM1蛋白表達(dá)狀況 例Table 1 ERCC1 and RRM1 protein expression tested by IHC

2.2 液相芯片檢測(cè)NSCLC組織中ERCC1和RRM1 mRNA表達(dá)

經(jīng)液相芯片檢測(cè)的腫瘤組織中ERCC1低表達(dá)21例，中偏低表達(dá)18例，中偏高表達(dá)2例，高表達(dá)1例；RRM1低表達(dá)9例，中偏低表達(dá)23例，中偏高表達(dá)4例，高表達(dá)6例（表2）。

表2 液相芯片檢測(cè)ERCC1、RRM1 mRNA表達(dá)狀況 例Table 2 ERCC1 and RRM1 mRNA expression tested by a suspension biochip

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)的蛋白水平與液相芯片檢測(cè)的mRNA水平的相關(guān)性

兩種檢測(cè)方法測(cè)定的NSCLC中ERCC1、RRM1蛋白及mRNA表達(dá)一致率分別為52.3%（22/42）和76.2%（32/42）；進(jìn)一步相關(guān)性分析表明，兩種方法檢測(cè)的腫瘤組織中RRM1和ERCC1的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.778，P=0.010；r=0.277，P=0.076）。

3 討論

ERCC1和RRM1均參與細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)過程，目前已經(jīng)有多個(gè)研究結(jié)果顯示ERCC1和RRM1是NSCLC患者接受順鉑＋吉西他濱方案化療療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)。其中，RRM1的表達(dá)水平與NSCLC對(duì)吉西他濱的療效呈負(fù)相關(guān)［5-6］，ERCC1高表達(dá)與鉑類耐藥相關(guān)［7-8］。檢測(cè)ERCC1、RRM1表達(dá)水平對(duì)患者個(gè)體化化療及生存預(yù)后具有重要意義。當(dāng)前關(guān)于上述兩個(gè)因子基因表達(dá)水平檢測(cè)的方法主要有測(cè)序、熒光定量PCR及液相芯片技術(shù)，蛋白表達(dá)水平上的檢測(cè)常用免疫組織化學(xué)技術(shù)。

IALT研究是第一個(gè)通過檢測(cè)腫瘤標(biāo)本中ERCC1蛋白表達(dá)水平來評(píng)估其臨床意義的大規(guī)模臨床試驗(yàn)，Olaussen等［9］采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)783例NSCLC患者腫瘤組織中ERCC1蛋白表達(dá)水平，將患者分為ERCC1表達(dá)陽性（335例，44%），ERCC1陰性（426例，56%）。ERCC1陰性的患者隨機(jī)接受含鉑方案輔助化療生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P=0.002），ERCC1陽性患者無論是否接受含鉑方案輔助化療，生存情況無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義（P=0.40），因此認(rèn)為手術(shù)完全切除的ERCC1陰性NSCLC患者更適合基于順鉑的輔助化療。對(duì)于未予輔助化療的患者，ERCC1陰性預(yù)示著較短生存期。RRM1是鹽酸吉西他濱耐藥的一個(gè)重要預(yù)測(cè)指標(biāo)，Gao等［10］通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了75例晚期非小細(xì)胞肺癌患者組織中RRM1蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)RRM1蛋白低表達(dá)使用吉西他濱的化療反應(yīng)率及1年生存率均高于RRM1高表達(dá)者，因此認(rèn)為RRM1蛋白表達(dá)水平與晚期非小細(xì)胞肺癌患者吉西他濱化療有效率相關(guān)。

液相芯片是一種全新概念的生物芯片，該技術(shù)的核心是把微小的聚苯乙烯小球用熒光顏色的方法進(jìn)行編碼，然后將每種顏色的微球共價(jià)交聯(lián)上針對(duì)特定檢測(cè)物的探針、抗原或抗體，微球與待測(cè)樣本在懸液中結(jié)合后通過兩束激光分別識(shí)別編碼微球和檢測(cè)微球上報(bào)告分子的熒光強(qiáng)度進(jìn)而獲得待測(cè)樣本濃度。液相芯片具有簡(jiǎn)單快速、敏感度好、特異性高、節(jié)省樣本量、縮短分析時(shí)間、節(jié)約勞動(dòng)力、檢測(cè)費(fèi)用低，以及多通路、高通量和實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析等優(yōu)點(diǎn)［11］。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析及受體與配體的識(shí)別分析等領(lǐng)域中。本研究使用廣州益善公司提供的液相芯片分析平臺(tái)，檢測(cè)42例NSCLC組織中ERCC1、RRM1 mRNA表達(dá)水平，同時(shí)使用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織中ERCC1、RRM1蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)兩種檢測(cè)方法檢測(cè)的非小細(xì)胞肺癌RRM1表達(dá)一致率為88.5%（23/26）。進(jìn)一步的相關(guān)性分析表明，兩種方法測(cè)定的腫瘤組織中RRM1的表達(dá)水平有良好的相關(guān)性（r=0.793，P=0.01），即腫瘤組織中RRM1mRNA表達(dá)水平與組織中RRM1蛋白水平具有一致性。Giovannetti等［12］對(duì)12例胰腺癌冰凍切片中RRM1mRNA表達(dá)與RRM1免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)弱進(jìn)行對(duì)比，也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)論：腫瘤細(xì)胞中RRMI免疫組化染色強(qiáng)弱與其基因表達(dá)相關(guān)，RRM1mRNA高表達(dá)者免疫組化染色強(qiáng)而彌漫，中等強(qiáng)度表達(dá)者染色較弱，而低表達(dá)者僅可見散在的腫瘤細(xì)胞弱染色。因此對(duì)于腫瘤組織中RMM1的表達(dá)，無論是使用液相芯片法檢測(cè)其mRNA表達(dá)水平或是免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)RRM1蛋白表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果具有較好一致性，檢測(cè)結(jié)果均可用于指導(dǎo)患者個(gè)體化化療方案的確定及預(yù)后評(píng)估。兩種檢測(cè)方法測(cè)定的ERCC1表達(dá)一致率為57.7%（15/26），相關(guān)性分析表明，兩者相關(guān)系數(shù)為0.249，兩者雖有相關(guān)趨勢(shì)，但由于病例數(shù)少，無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Vilmar等［13］分別使用RT-PCT及免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)33例行手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌組織樣本中ERCC1mRNA及ERCC1蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)患者組織樣本中ERCC1mRNA表達(dá)水平與ERCC1蛋白表達(dá)水平并無明顯相關(guān)性，在進(jìn)行預(yù)后分析時(shí)，將患者分為ERCC1蛋白陽性表達(dá)組及陰性表達(dá)組，ERCC1蛋白陰性患者總生存優(yōu)于ERCC1蛋白陽性表達(dá)者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而基于ERCC1mRNA表達(dá)程度將患者分組卻未得到類似結(jié)果。因此認(rèn)為，檢測(cè)技術(shù)不同，由此產(chǎn)生的分組狀況不同，對(duì)患者生存預(yù)后的評(píng)估也就不同，因此有必要同時(shí)應(yīng)用多種檢測(cè)手段同時(shí)檢測(cè)腫瘤靶標(biāo)表達(dá)狀況。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)非小細(xì)胞肺癌靶標(biāo)對(duì)患者生存預(yù)后影響的研究中，分子標(biāo)記物的檢測(cè)大多是基于單一的免疫組織化學(xué)技術(shù)或基因擴(kuò)增技術(shù)，從蛋白水平或基因水平檢測(cè)分子靶標(biāo)的表達(dá)，并以此為依據(jù)將患者分組進(jìn)行生存預(yù)后評(píng)估。少有臨床研究同時(shí)從蛋白水平及基因水平檢測(cè)分子靶標(biāo)的表達(dá)并分組進(jìn)行臨床預(yù)后評(píng)估。本研究使用免疫組織化學(xué)法及液相芯片法同時(shí)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織樣本中ERCC1、RRM1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)組織樣本中ERCC1基因表達(dá)與ERCC1蛋白表達(dá)狀況并不完全一致。前述Vilmar等［13］的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，原因可能為應(yīng)用檢測(cè)平臺(tái)及檢測(cè)標(biāo)記物不同，免疫組織化學(xué)主要檢測(cè)靶標(biāo)蛋白水平的表達(dá)，而液相芯片檢測(cè)靶標(biāo)信使RNA的表達(dá)，從遺傳信息的傳遞過程來解釋，轉(zhuǎn)錄的信使RNA并不僅是翻譯為有功能的蛋白質(zhì)，鑒于本研究樣本量少，且大多數(shù)為I期患者，部分患者術(shù)后無需進(jìn)行輔助化療，無法依據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)患者分組進(jìn)行化療療效及生存預(yù)后評(píng)估，可以肯定的是二種方法同時(shí)檢測(cè)可進(jìn)一步選擇優(yōu)勢(shì)人群，增加臨床化療的敏感性和特異性。

ERCC1及RRM1作為非小細(xì)胞肺癌個(gè)體化治療靶標(biāo)對(duì)患者治療及生存預(yù)后的指導(dǎo)意義已為眾多文獻(xiàn)所報(bào)告，本研究的意義在于發(fā)現(xiàn)了因檢測(cè)技術(shù)不同所造成的靶標(biāo)檢測(cè)結(jié)果差異，并提出了依據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)患者分組進(jìn)行化療療效及生存預(yù)后評(píng)估的新課題。

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（2012-12-11收稿）（2013-02-04修回）

Suspension biochip versus immunohistochemistry for ERCC1 and RRM1 detection in non-small cell lung cancer

Yanzheng HU1,2,Wei WANG2,Liqun SHANG2,Xuechang LI2,Feng WEN2,Jun LI2,Junqiang LIU2

Wei WANG;E-mail:wangyr02@hotmail.com
1Third Clinical Medicine of Southern Medical University,Guangdong 510515,China
2Department of Thoracic Surgery,Naval General Hospital of PLA,Beijing 100048,China

Objective:With the treatment of non-small cell lung cancer(NSCLC)entering the era of individualization through the detection of expression levels of promising biomarkers in NSCLC tumor samples,tailored chemotherapy,and prognosis evaluation for NSCLC patients are now possible.This study focuses on two commonly utilized detection methods:immunohistochemistry(IHC)and suspension biochip.This study aims to determine the differences between IHC and suspension biochip with regard to the expression levels of biomarkers.Methods:Forty-two NSCLC patients were enrolled into the study from April 2011 to June 2012.The expression levels of excision repair cross-complementing group 1(ERCC1)and ribonucleotide reductase(RRM1)in the tumor samples were tested through IHC and suspension biochip,respectively.The statistical methods used in the analysis were were performed with the SPSS(version 17.0)statistical software;P＜0.05 was considered statistically significant.Results:The consistent rates of the ERCC1 and RRM1 expression levels tested by IHC and suspension biochip were 52.3%(22/42)and 76.2%(32/42),respectively.A significant correlationship was observed between IHC and suspension biochip in terms of the RRM1 expression levels(r=0.778,P=0.01).No such correlationship was found in the ERCC1 expression levels(r=0.277,P=0.076).Conclusion:The expression levels of RRM1 tested by the two methods exhibited good correlationship.The expression levels of the RRM1 mRNA in the NSCLC tissues were consistent with RRM1 protein expression.No significant correlationship was found in the expression levels of ERCC1 tested by the two methods.The expression levels of the ERCC1 mRNA in the NSCLC tissues were not always correlated with ERCC1 protein expression.The simultaneous use of IHC and suspension biochip can increase the sensitivity and specificity of chemotherapy.

NSCLC,ERCC1,RRM1,immunohistochemistry,suspension biochip

10.3969/j.issn.1000-8179.2013.06.012

①南方醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院（廣州市510515）；②中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院

王偉 wangyr02@hotmail.com

（本文編輯：楊紅欣）