卵巢上皮性癌組織中DAPK基因啟動子甲基化及其蛋白表達(dá)的研究

高玉霞 李紅雨 班振英 張紅巖 賈冬麗 姚俊閣 馬學(xué)玲

卵巢上皮性癌組織中DAPK基因啟動子甲基化及其蛋白表達(dá)的研究

高玉霞 李紅雨 班振英 張紅巖 賈冬麗 姚俊閣 馬學(xué)玲

目的：研究卵巢上皮性癌組織中DAPK基因啟動子甲基化及其蛋白表達(dá)在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及意義。方法：應(yīng)用甲基化特異性PCR（MSP）檢測55例卵巢上皮性癌（惡性組）、25例卵巢交界性上皮性腫瘤（交界組）、30例卵巢良性上皮性腫瘤（良性組）、25例正常卵巢上皮組織（正常組）的石蠟包埋組織中DAPK基因啟動子的甲基化情況。應(yīng)用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接（S-P）法檢測上述蠟塊組織中DAPK蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：DAPK啟動子在正常組、良性組、交界組、惡性組的甲基化率分別為0（0/25）、6.7%（2/30）、16.0%（4/25）、47.3%（26/55），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），惡性組的甲基化率高于其他三組；DAPK蛋白在正常組、良性組、交界組、惡性組的陽性表達(dá)率分別為96.0%（24/25）、90.0%（27/30）、48.0%（12/25）、30.9%（17/55），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），惡性組、交界組的陽性表達(dá)率均低于正常組和良性組；DAPK基因啟動子甲基化和DAPK蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論：DAPK基因啟動子甲基化導(dǎo)致基因沉默、失活，引起蛋白表達(dá)下調(diào)或缺失，并參與了卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展。

卵巢上皮性癌 DAPK DNA 免疫組織化學(xué)

卵巢癌為女性生殖系統(tǒng)三大常見惡性腫瘤之一，死亡率居首，病因及發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，因起病隱匿、缺乏早期診斷指標(biāo)，多數(shù)確診時已屬晚期，總體5年生存率仍未超過45%［1］。卵巢上皮性癌占卵巢癌的85%～90%，研究卵巢上皮性癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)，改善預(yù)后仍是研究的熱點(diǎn)。死亡相關(guān)蛋白激酶（death-associated protein kinase gene，DAPK）是凋亡的正性調(diào)節(jié)因子，作為抑癌基因，在多種人類腫瘤中由于啟動子甲基化而表達(dá)缺失［2］。國外研究報(bào)道DAPK基因啟動子在卵巢上皮性癌中的甲基化率0～67%不等［3］，存在分歧，仍需進(jìn)一步研究。本研究通過對卵巢上皮性癌中DAPK基因啟動子甲基化及蛋白表達(dá)的檢測，探討DAPK在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用，以期為卵巢癌的診治尋找新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 收集2009年1月至2012年3月鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科135例石蠟包埋組織，經(jīng)病理證實(shí)為卵巢上皮性癌組織（惡性組）55例，卵巢交界性上皮腫瘤（交界組）25例，卵巢良性上皮性腫瘤（良性組）30例，正常卵巢上皮組織（正常組）25例。正常卵巢組織來源于因良性疾病行子宮加雙附件切除術(shù)的患者。卵巢上皮性癌患者年齡為23～78歲，中位年齡為53歲，其中漿液性囊腺癌35例，黏液性囊腺癌12例，子宮內(nèi)膜樣癌8例。按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期：Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期40例；低分化19例，中～高分化36例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例；術(shù)前均未行放療和化療。所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，行4 μm厚連續(xù)切片用于免疫組織化學(xué)，收集10 μm厚連續(xù)切片5～10張置PE管保存以用于提取DNA。全部標(biāo)本均由病理科醫(yī)師再次診斷證實(shí)，標(biāo)本使用符合倫理委員會認(rèn)可。

1.1.2 試劑 DAPK兔抗人多克隆抗體（工作濃度1∶50）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。二抗及顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。甲基化特異性試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和甲基化特異性PCR（MSP） 石蠟組織中DNA提取方法：采用酚-氯仿法提取石蠟組織中的DNA，并按照甲基化特異性PCR試劑盒說明書進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，-20℃保存?zhèn)溆没蛑苯訑U(kuò)增。引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［4］，由北京博大泰克生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成2對引物。甲基化引物正義鏈為 5'-GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC-3'，反 義鏈為5'-CCCTCCCAAACGCCGA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為98 bp；未甲基化引物正義鏈為5'-GGAGGATAGTTGG ATTGAGTTAATGTT-3'，反義鏈為 5'-CAAATCCCTC CCAAACACCAA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為106 bp。

1.2.2 MSP反應(yīng) 反應(yīng)體系：亞硫酸氫鹽修飾后DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，10×PCR 緩沖液5 μL，高效DNA聚合酶1 μL，dNTPs 4 μL加3dH2O至50 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，1個循環(huán)；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。取產(chǎn)物5 μL于2%瓊脂糖凝膠上電泳。甲基化結(jié)果判斷：甲基化引物擴(kuò)增出目的條帶者為甲基化陽性；非甲基化引物擴(kuò)增出目的條帶，或甲基化引物未擴(kuò)增出目的條帶者為甲基化陰性。

1.2.3 DAPK蛋白表達(dá)檢測方法 采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接（S-P）法，具體實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明進(jìn)行。陰性對照以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗。免疫組織化學(xué)結(jié)果判定：DAPK蛋白表達(dá)于胞漿，免疫組織化學(xué)染色以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。依據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率進(jìn)行半定量評分［5］。著色強(qiáng)度：輕度著色為1分，中度著色為2分，強(qiáng)著色為3分。每張染色切片隨機(jī)選取10個高倍視野（×400），計(jì)算10個視野的平均陽性細(xì)胞百分率。陽性細(xì)胞百分率：＜10%為1分，10%～49%為2分，50%～80%為3分，＞80%為4分。兩項(xiàng)乘積為免疫染色的總分?？偡?～1分為陰性（-），2～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組定性資料比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，組間兩兩比較時應(yīng)用四格表χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α'=α/比較次數(shù)，為0.008 3。兩分類變量的相關(guān)性分析應(yīng)用配對資料的關(guān)聯(lián)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，關(guān)聯(lián)程度使用Pearson列聯(lián)系數(shù)（rp）表示。

2 結(jié)果

2.1 DAPK基因在不同卵巢組織中的甲基化情況

正常卵巢上皮組織未擴(kuò)增出甲基化陽性條帶，良性、交界性及惡性卵巢上皮性腫瘤組織中均可擴(kuò)增出甲基化陽性條帶。DAPK基因啟動子在正常組、良性組、交界組、惡性組中的甲基化率分別為0（0/25）、6.7%（2/30）、16.0%（4/25）、47.3%（26/55），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=38.070，P＜0.001）。惡性組和正常組、良性組、交界組分別比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為17.508、14.489、7.172，P＜0.001、P＜0.001、P=0.007）。正常組和良性組、正常組和交界組、良性組和交界組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為0.350、2.446、1.222，P=0.554、P=0.118、P=0.269，表1，圖1）。

2.2 DAPK蛋白在不同卵巢上皮組織中的表達(dá)情況

DAPK蛋白在正常卵巢組織和良性卵巢上皮性腫瘤組織中高表達(dá)，以（++）和（+++）為主，陽性率分別為96.0%（24/25）、90.0%（27/30），而在交界性卵巢上皮腫瘤組織及卵巢上皮性癌組織中表達(dá)下降或缺失，以（+）和（-）為主，陽性率分別為48.0%（12/25）、30.9%（17/55），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=45.344，P＜0.001）。正常組和交界組、惡性組比較，良性組和交界組、惡性組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為14.286、29.146、11.661、27.600，P＜0.001、P＜0.001、P=0.001、P＜0.001）。正常組和良性組比較，交界組和惡性組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為0.11、2.172，P=0.74、P=0.14，表2，圖2）。

表1 DAPK基因啟動子在不同卵巢上皮組織中的甲基化率比較Table 1 Comparison between the methylation rates of death-associated protein kinase（DAPK）promoter in different epithelial ovarian tissues

圖1 DAPK基因在不同卵巢上皮組織中的甲基化情況Figure 1 Methylation of DAPK promoter in different epithelial ovarian tissues detected by methylation-specific polymerase chain reaction

表2 DAPK蛋白在不同卵巢上皮組織中的表達(dá)Table 2 Expression of DAPK protein in different epithelial ovarian tissues

2.3 卵巢上皮性癌中DAPK基因啟動子甲基化及其蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

26例擴(kuò)增出甲基化條帶的卵巢上皮性癌組織中1例DAPK蛋白表達(dá)陽性，29例未擴(kuò)增出甲基化條帶的卵巢上皮性癌組織中13例DAPK蛋白表達(dá)陰性。DAPK基因啟動子甲基化與其蛋白的表達(dá)與之間呈負(fù)相關(guān)（χ2=16.911，P＜0.001，rp=0.485，表3）。

圖2 DAPK蛋白在不同卵巢組織中的表達(dá)（SP×400）Figure 2 DAPK protein expression in different epithelial ovarian tissues（SP ×400）

表3 卵巢上皮性癌組織中DAPK基因啟動子甲基化及其蛋白表達(dá)的關(guān)系Table 3 Correlation between DAPK promoter methylation and its protein expression

2.4 DAPK基因啟動子甲基化及其蛋白表達(dá)與卵巢上皮性癌臨床病理特征的關(guān)系

DAPK基因啟動子甲基化及其蛋白表達(dá)與卵巢上皮性癌的分期、病理類型、組織分化均無關(guān)（P＞0.05），DAPK基因甲基化及其蛋白表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05，表4）。

表4 卵巢上皮性癌組織中DAPK基因甲基化及其蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Table 4 Correlation between DAPK promoter methylation，its protein expression，and clinicopathological features in epithelial ovarian carcinomas

表4 卵巢上皮性癌組織中DAPK基因甲基化及其蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（續(xù)表4）Table 4 Correlation between DAPK promoter methylation，its protein expression，and clinicopathologic features in epithelial ovarian carcinomas（continue table 4）

3 討論

卵巢癌的發(fā)生是多步驟、多因素、多機(jī)制參與的復(fù)雜過程，其中包括癌基因的激活和抑癌基因的失活。基因甲基化被認(rèn)為是抑癌基因失活的重要機(jī)制。卵巢癌中存在多種腫瘤相關(guān)基因頻繁甲基化現(xiàn)象，包括OPCML、GATA4、TES、TGFBI以及本研究中的DAPK［3，6］。DAPK是一種鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的組氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過誘導(dǎo)凋亡和自噬，并抑制腫瘤細(xì)胞黏附、侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展［2］。在腫瘤形成的早期階段，DAPK依賴p19ARF活化p53介導(dǎo)的凋亡檢查點(diǎn)，阻止癌基因的活化。DAPK活化后可促進(jìn)p53表達(dá)和轉(zhuǎn)錄能力，導(dǎo)致Caspase依賴的細(xì)胞死亡［7］。在腫瘤轉(zhuǎn)移的多階段過程DAPK增加腫瘤細(xì)胞對程序性細(xì)胞死亡的敏感性而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移［8］。DAPK通過抑制整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附而活化依賴p53的細(xì)胞凋亡，并能抑制細(xì)胞外基質(zhì)生存信號誘導(dǎo)凋亡［9］。特定情況下自噬可以抑制腫瘤發(fā)生，DAPK可通過多途徑多階段調(diào)節(jié)自噬發(fā)揮腫瘤抑制作用［2，10］。

Collins等［4］研究發(fā)現(xiàn)DAPK基因啟動子在30例卵巢癌組織樣本中20例（67%）發(fā)生了甲基化，在26例卵巢癌患者的外周血樣本中14例（54%）出現(xiàn)了甲基化，在正常個體基因組DNA樣本及轉(zhuǎn)化的正常卵巢上皮細(xì)胞株中均未發(fā)生甲基化。H?fner等［11］研究發(fā)現(xiàn)50%（16/32）卵巢癌組織標(biāo)本中存在DAPK基因甲基化，56%（13/23）的卵巢癌患者血漿中存在DAPK基因甲基化。本研究發(fā)現(xiàn)DAPK基因啟動子在卵巢上皮性癌組織樣本中的甲基化率為47.3%（26/55），與上述研究結(jié)果一致。本研究還顯示，DAPK基因啟動子在正常組中未發(fā)生甲基化，在良性組、交界組、惡性組甲基化率逐漸升高，惡性組高于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.008 3），提示DAPK基因啟動子甲基化可能為卵巢上皮性癌發(fā)生過程中的早期事件和重要事件。

DAPK在Barrett食管腺癌、胃癌、宮頸癌等人類腫瘤中表達(dá)下調(diào)或丟失，且均與其基因啟動子甲基化有關(guān)［5，12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)DAPK蛋白在正常組、良性組、交界組、惡性組的表達(dá)逐漸降低，交界組和惡性組明顯低于正常組和良性組，提示DAPK表達(dá)下調(diào)或丟失參與了卵巢上皮性癌由良性-交界-惡性的發(fā)展過程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DAPK在卵巢上皮性癌中表達(dá)下調(diào)或丟失與其啟動子的甲基化相關(guān)，與其在上述人類腫瘤中的研究結(jié)果一致，提示DAPK基因啟動子甲基化可導(dǎo)致基因沉默、失活、蛋白表達(dá)下調(diào)或丟失，使其誘導(dǎo)凋亡和自噬、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等作用減弱而促進(jìn)了卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示基因水平與蛋白水平存在不一致現(xiàn)象：基因水平DAPK基因啟動子甲基化在交界組和惡性組有差異，但蛋白表達(dá)在交界組和惡性組間無差異，且29例未發(fā)生甲基化的卵巢上皮性癌組織中仍有13例陰性表達(dá)，原因可能是除了甲基化外DAPK還可通過組蛋白去乙?；?、基因突變、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等機(jī)制影響基因表達(dá)［14］。

DAPK基因甲基化與卵巢上皮性癌的臨床分期、病理類型、組織分化均無關(guān)，與Collins等［4］研究結(jié)果一致。DAPK蛋白表達(dá)與卵巢上皮性癌的臨床分期、病理類型、組織分化亦無關(guān)。DAPK基因甲基化及其蛋白表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這可能與DAPK失活后不能正常發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的能力有關(guān)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移常關(guān)系到患者的預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)在胃癌中DAPK甲基化與其預(yù)后相關(guān)［15］，但Collins等［4］研究發(fā)現(xiàn)DAPK甲基化與卵巢癌患者生存無關(guān)，DAPK與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系仍有待今后進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)卵巢上皮性癌組織中DAPK基因啟動子發(fā)生了中等程度甲基化現(xiàn)象，可能為DAPK表達(dá)下調(diào)或缺失的主要機(jī)制之一，并參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，且可能與卵巢癌預(yù)后有關(guān)。DAPK基因啟動子甲基化為卵巢癌發(fā)生的早期事件，已研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者的外周血中存在DAPK的同步甲基化［4］，通過檢測血液中DAPK基因甲基化將可能有助于卵巢癌的早期診斷?；蚣谆哂锌赡嫘?，通過去甲基化藥物恢復(fù)DAPK基因表達(dá)及其抑癌功能有望成為上皮性卵巢癌治療的新靶點(diǎn)。

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（2012-09-13收稿）

（2013-02-18修回）

Methylation and protein expression of death-associated protein kinase promoter in epithelial ovarian carcinomas

Yuxia GAO,Hongyu LI,Zhenying BAN,Hongyan ZHANG,Dongli JIA,Junge YAO,Xueling MA

Hongyu LI;E-mail:tjlhylucky@yahoo.com.cn
Department of Obstetrics and Gynecology,The ThirdAffiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China

Objective:This study aimed to investigate the methylation and protein expression of death-associated protein kinase(DAPK)promoter in epithelial ovarian carcinoma(EOC).This study also aimed to evaluate the functions of DAPK methylation and protein expression in EOC development.Methods:Methylation-specific polymerase chain reaction was performed to detect DAPK promoter methylation in paraffin-embedded tissue specimens.The following specimens were examined:55 cases of EOC tissues(malignant group);25 borderline epithelial ovarian neoplasms(borderline group);30 cases of benign epithelial ovarian neoplasms(benign group);and 25 cases of normal epithelial ovarian tissue(normal group).Immunohistochemical streptavidin-peroxidase method was also performed to assess DAPK expression in the aforementioned specimens.Results:The rate of DAPK promoter methylation was 0%(0/25),6.7%(2/30),16.0%(4/25),and 47.3%(26/55)in normal,benign,borderline,and malignant groups,respectively.This rate was significantly higher in the malignant group than in the three groups(P＜0.008 3).The rate of DAPK-positive protein expression was 96.0%(24/25),90.0%(27/30),48.0%(12/25),and 30.9%(17/55)in normal,benign,borderline,and malignant groups,respectively.This rate was significantly lower both in malignant and borderline groups than that in benign and normal groups,respectively(P＜0.008 3).Thus,DAPK promoter methylation was negatively correlated with its protein expression.Conclusion:DAPK promoter methylation caused gene silencing and inactivity,thereby resulting in downregulation or loss of DAPK promoter protein expression,which contributed to oncogenesis and progression of EOCs.

epithelial ovarian carcinoma,DAPK,DNAmethylation,immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1000-8179.2013.06.005

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（鄭州市450052）

李紅雨 tjlhylucky@yahoo.com.cn

（本文編輯：張亻 刡 ）