腫瘤間質(zhì)比是非小細胞肺癌獨立的預后因素

王兆峰 劉紅兵 趙仁德 張鶴 劉春花 宋勇

近期發(fā)表的文獻[1]顯示：2012年肺癌的死亡率仍將處于各種腫瘤首位，新發(fā)病例居第二位。在諸多西方國家，近15年肺癌的發(fā)病率已達高峰并呈下降趨勢，而我國肺癌的發(fā)病率卻呈持續(xù)上升趨勢[2]。鑒于肺癌高發(fā)病率和死亡率，提高肺癌的診治水平，改善患者預后已成為亟待解決的難題。近年來，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）作為最常見的組織病理類型研究較多。生存相關的研究[3-6]已證實年齡、KPS評分、TNM分期等是NSCLC的獨立預后因素。但是，我們是否可以在進行病理診斷的同時根據(jù)組織標本的病理形態(tài)表現(xiàn)預測患者的預后呢？Mesker、Wang等[7-11]研究表明：在結(jié)直腸癌、乳腺癌、食管鱗癌及食管腺癌等多種實體瘤內(nèi)，腫瘤組織內(nèi)腫瘤與間質(zhì)的比例（tumor-stroma ratio, TSR）被證明是一種新的、可靠的獨立預后因子，且此評估方法簡單，切實可行，重復性好。但TSR對NSCLC患者的預后價值目前尚無相關研究，本實驗旨在證實TSR在NSCLC中的預后價值。

1 材料與方法

1.1 材料 選取南京軍區(qū)南京總醫(yī)院2000年1月-2007年1月手術(shù)切除的經(jīng)常規(guī)病理證實的NSCLC標本73例。73例NSCLC中，男性50例，女性23例；年齡30歲-75歲，中位年齡59歲。所有NSCLC病例術(shù)前未經(jīng)化療和放療，術(shù)后病理證實為NSCLC（鱗癌35例，腺癌33例，腺鱗癌5例），術(shù)后經(jīng)過2個-4個療程的以鉑類為基礎的化療。按照UICC分期委員會第7版TNM分期標準，分為I期22例，II期28例，III期23例。

1.2 方法 將術(shù)后組織常規(guī)石蠟包埋，制片成厚度為4 μm切片。采用蘇木素染色法，按常規(guī)程序脫蠟和水化。PBS液沖洗后，用蘇木素（北京中杉金橋公司）進行染色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 實驗結(jié)果的判定 實驗結(jié)果根據(jù)參考文獻[7]判定：常規(guī)鏡檢蘇木素染色后的切片，50×放大倍數(shù)下選取腫瘤浸潤最明顯的區(qū)域。常規(guī)認為該區(qū)域有兩部分組成：腫瘤細胞部分和間質(zhì)部分，用百分比表示。然后，在該區(qū)域內(nèi)100×倍放大倍數(shù)下評估單視野范圍內(nèi)腫瘤細胞面積所占該視野的百分比（carcinoma percentage, CP），剩余百分比即為間質(zhì)百分比（例：如果腫瘤細胞面積占該視野40%，間質(zhì)成分面積所占百分比即為60%。取10%為取值區(qū)間，即：20%、30%等），計算腫瘤內(nèi)部的TSR。選取2個-4個視野進行評估，取CP值最低的一個確定為最終取值。因計算的為腫瘤內(nèi)部的TSR，故該視野范圍內(nèi)間質(zhì)周圍必須是有腫瘤細胞浸潤。不能選取間質(zhì)較多，間質(zhì)周圍無腫瘤細胞的區(qū)域進行評估。根據(jù)TSR評估結(jié)果，選取CP為50%的cut-off值，將病例分為兩組：將CP值＜50%病例定義為間質(zhì)豐富組（stroma-rich group）而CP值≥50%視野定義為間質(zhì)稀少組（stroma-poor group）。以上評估過程主要由2名病理專家完成，當2名專家意見不一致時根據(jù)第32名病理專家的意見確認最終結(jié)果。

1.4 隨訪 患者從手術(shù)日期開始隨訪，至患者死亡結(jié)束，生存者至2012年5月31日終止隨訪。

1.5 統(tǒng)計處理 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計處理，采用卡方檢驗、Kaplan-Meier生存分析和Cox回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TSR在NSCLC組織中的分布 根據(jù)以上試驗方法，在73例NSCLC組織中，間質(zhì)豐富組27例，間質(zhì)稀少組46例，比例分別為37%、63%。不同TSR在肺鱗癌及腺癌中病理形態(tài)學示例如圖1所示。

2.2 TSR分組與臨床病理參數(shù)的關系 根據(jù)TSR結(jié)果，間質(zhì)稀少組與間質(zhì)豐富組在性別、年齡、吸煙、腫瘤大小、病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM分期間無統(tǒng)計學差異。結(jié)果見表1。

2.3 不同TSR分組與NSCLC預后的關系 73例NSCLC患者從手術(shù)日期開始隨訪，至患者死亡結(jié)束，未死亡的至2012年5月31日截止隨訪。用Kaplan-Meier生存分析和Logrank檢驗統(tǒng)計分析，TSR兩分組之間OS差異有統(tǒng)計學意義（P=0.014），結(jié)果顯示間質(zhì)稀少組患者中位生存時間為1,169 d，間質(zhì)豐富組的患者中位生存時間為808 d。間質(zhì)豐富組的患者OS明顯低于間質(zhì)稀少組的患者（圖2）。對性別、年齡、吸煙、腫瘤大小、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期、分化程度及TSR分組9個因素進行Cox模型多因素分析（表2）可見，TSR是影響NSCLC預后的獨立因素（HR=1.832, 95%CI: 1.017-3.299），pTNM分期也是影響NSCLC獨立預后因素（HR=1.953, 95%CI: 1.284-2.970），而性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度均非NSCLC預后的獨立因素。

3 討論

本實驗采用蘇木素法對73例NSCLC手術(shù)切除標本的TSR進行檢測，根據(jù)TSR評估結(jié)果，選取CP%為50%的cut-off值，將病例分為兩組：間質(zhì)豐富組（stroma-rich group）和間質(zhì)稀少組（stroma-poor group）。統(tǒng)計分析顯示：間質(zhì)豐富組患者預后明顯差于間質(zhì)稀少組，兩組OS差異有統(tǒng)計學意義（P=0.014），并證明TSR是NSCLC獨立的預后因子（HR=1.832, 95%CI: 1.017-3.299）。該實驗對TSR在NSCLC中的預后價值做出了評價。

圖 1 TSR在不同病理類型肺組織中的表達。A：鱗癌間質(zhì)稀少組；B：腺癌間質(zhì)稀少組；C：鱗癌間質(zhì)豐富組；D：腺癌間質(zhì)豐富組（×100）。Fig 1 The expression of TSR in lung tissue of different kinds of histology. A: The stroma-poor group of squamous cell lung carcinoma; B: The stroma-poor group of lung adenocarcinoma; C: The stroma-rich group of squamous cell lung carcinoma;D: The stroma-poor group of lung adenocarcinoma (×100).

圖 2 73例NSCLC患者Kaplan-Meier生存分析。結(jié)果顯示間質(zhì)稀少組患者中位生存時間為1,169 d，間質(zhì)豐富組的患者中位生存時間為808 d。間質(zhì)豐富組的患者OS明顯低于間質(zhì)稀少組的患者（P=0.014）。Fig 2 Kaplan-Meier survival analysis of 73 cases with NSCLC.Results show that the median survival time in the stroma-poor group was 1,169 d, and 808 d in the stroma-rich group. OS days of patients in stroma-rich group were significantly lower than the stroma-poor group (P=0.014). OS: Overall survival.

目前，關于TSR在實體瘤中的預后價值，研究尚少。荷蘭學者Mesker等在前期的研究中發(fā)現(xiàn)：在實體瘤內(nèi)，與腫瘤組織接觸的間質(zhì)組織可能影響患者的預后。為進一步證實上述現(xiàn)象，Mesker等[7]用HE染色的方法對122例I期-III期的結(jié)直腸癌患者手術(shù)組織進行病理形態(tài)分析及評估，并隨訪患者預后。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：選取CP為50%的cut-off值對患者進行分組，CP≥50%組的患者OS和無病生存（disease-free survival, DFS）均長于CP＜50%組。該實驗同時發(fā)現(xiàn)，隨著結(jié)直腸癌分期的遞進，CP值越小。該實驗結(jié)果與本實驗相似，但兩實驗結(jié)果統(tǒng)計分析未見TNM分期與TSR有相關性，由于兩實驗樣本量相對較少，需要增加樣本量以進一步研究。為進一步研究TSR在結(jié)直腸癌中的價值，Mesker等[10]開展了另一組含135例I期-II期結(jié)直腸癌患者的研究，預后分析進一步證實了TSR在結(jié)直腸癌中的預后價值。Courrech Staal等[9]對93例食管腺癌術(shù)后組織的TSR進行評估并隨訪患者預后，發(fā)現(xiàn)CP高組患者的DFS明顯長于CP低組，并證實TSR是食管腺癌獨立的預后因素（HR=2.006, 95%CI: 1.181-3.407）。關于TSR與NSCLC預后的關系，目前尚無相關報道。本實驗結(jié)果顯示：通過對73例NSCLC術(shù)后組織切片蘇木素染色后發(fā)現(xiàn)，間質(zhì)稀少組患者中位生存時間為1,169 d， 間質(zhì)豐富組的患者中位生存時間為808 d。間質(zhì)豐富組的患者OS明顯低于間質(zhì)稀少組的患者，多因素Cox回歸分析顯示TSR是影響NSCLC預后的獨立因素（HR=1.832,95%CI: 1.017-3.299），與Mesker等以上研究結(jié)果相似。本實驗同時證實TNM分期是NSCLC獨立的預后因素，這與以往研究結(jié)論一致。

表 1 TSR與不同臨床病理特征間的關系Tab 1 The relationship between TSR and different clinical and pathological features

表 2 NSCLC預后因素多變量Cox回歸分析Tab 2 Multivariate Cox regression analysis of prognostic factors in NSCLC

腫瘤組織是由腫瘤細胞和復雜的間質(zhì)組成。在正常組織內(nèi)間質(zhì)具有屏障的作用，但在腫瘤組織內(nèi)，作為腫瘤微環(huán)境的間質(zhì)成分卻對腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移有易化作用[12]。新近研究[13,14]表明，在腫瘤演進過程中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是一個重要的決定性過程，此過程通過多個細胞內(nèi)通路參與腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移乃至“干細胞性”轉(zhuǎn)變等病理過程。在癌變的早期，腫瘤細胞的增殖未突破基底膜，與周圍間質(zhì)隔開，此為原位癌。當原位癌發(fā)展成浸潤性癌時，癌細胞穿過基底膜侵犯間質(zhì)，誘導正常間質(zhì)轉(zhuǎn)化為“活性間質(zhì)”[15]，此過程促進了成纖維細胞的增殖及細胞外基質(zhì)（extracellularmatrixc, ECM ）的沉積[16]，從而擴充了腫瘤間質(zhì)。而作為間質(zhì)重要成分的成纖維細胞，不僅在創(chuàng)傷愈合等多種炎癥反應中起作用，而且是腫瘤的關鍵性特征[17]。近年來，關于一種腫瘤間質(zhì)內(nèi)特殊的成纖維細胞-腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fi broblasts, CAFs）因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的特殊作用而逐漸得到重視。大部分侵襲性腫瘤的間質(zhì)都會有CAFs，CAFs具有較強的收縮能力，它可以合成ECM，從而刺激上皮細胞的增值，通過旁分泌不同生長因子及細胞因子，如：肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor, HGF）、胰島素生長因子（insulin-like growth factors, IGF）、神經(jīng)生長因子（neuron growth factor, NGF）等，活化后的CAFs可分泌高水平的細胞外金屬基質(zhì)蛋白酶，從而促進ECM組分的改變，影響上皮腫瘤細胞的演進[18-20]。除了對原發(fā)灶腫瘤細胞的作用，Olaso等[21]研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移灶內(nèi)活化的CAFs同樣可以促進腫瘤的增值。Balsamo等[22]發(fā)現(xiàn)CAFs還能夠調(diào)節(jié)免疫細胞功能以使腫瘤細胞獲得免疫逃逸。由以上研究可見，腫瘤組織內(nèi)的間質(zhì)成分通過多種通路參與了腫瘤發(fā)生、增殖及浸潤轉(zhuǎn)移的過程，從而影響患者的預后。但CAFs與其它間質(zhì)成分之間如何相互影響，以及EMT與CAFs之間的確切關系，這些相互作用機制與腫瘤的發(fā)生發(fā)展之間的確切關系，目前尚未完全清楚。

盡管本實驗對TSR在NSCLC中的預后價值做出了評價，但本實驗也存在一些缺陷，如：本實驗主要研究了NSCLC中常見的鱗癌、腺癌及腺鱗癌等病理類型，但NSCLC分型復雜，僅腺癌就有多種不同分類，形態(tài)學差異較大，因此有待于擴大樣本量，完善病理類型，進一步確認實驗結(jié)果。

總之，本研究提示通過組織病理形態(tài)分析有可能為NSCLC患者預后提供可靠信息，且該方法簡單可行。本實驗同時證實TSR是NSCLC患者獨立的預后因素。但是，關于TSR與NSCLC之間的機制關系尚未完全明確，尚待進一步研究。

致謝

感謝南京軍區(qū)南京總醫(yī)院病理科涂頻、李萬春醫(yī)師在該實驗的實驗方法及實驗結(jié)果評定部分中給予的幫助。