耐UV輻射微生物高通量篩選模型的建立及初步驗證

張志東，朱 靜，顧美英，王 瑋，石勁松，謝玉清，唐琦勇，宋素琴

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 微生物應(yīng)用研究所，新疆 烏魯木齊 830091；2.新疆醫(yī)科大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830091）

自1956年美國Anderson首次發(fā)現(xiàn)極端耐輻射微生物——耐輻射奇球菌（Deniococcus radiodurans）以來［1］，世界各國已從不同地區(qū)、不同環(huán)境分離出Deniococcus屬標(biāo)準(zhǔn)模式種40余個［2］。除此之外，其他屬如：Rubrobacter、Acinetobacter 、Chroococcidiopsis、Hymenobacter、Kineococcus、Kocuria、Methylobacte－rium、Thermococcus等屬多種微生物也具有較強(qiáng)的耐輻射特性［3］。研究表明，耐輻射微生物除具有極強(qiáng)的抗輻射特性外，其特殊的生命現(xiàn)象、生理機(jī)制，以及在環(huán)境工程、人類健康、生物技術(shù)乃至軍事、地外空間等方面的應(yīng)用前景，也成為科學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)［4－7］。

1 耐UV輻射微生物簡介

雖然從γ射線與UV線（紫外線）輻射造成的微生物致死的機(jī)理來看，γ射線為一種強(qiáng)電磁波，當(dāng)進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)部后，主要通過電離作用后的離子作用于如蛋白質(zhì)、核酸和酶等有機(jī)分子，而使其變性或突變，進(jìn)而使細(xì)胞失去活性［8］；UV輻射細(xì)胞主要作用于DNA，造成DNA的突變和失活［9］。兩者機(jī)理不同，但研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)耐γ射線輻射微生物均具有不同程度的耐UV輻射特性，并且兩者之間存在著一定的正相關(guān)特性［10］。耐UV輻射微生物的篩選因不需要特殊的實(shí)驗設(shè)備，且操作條件要求簡單，所以可以更加方便、容易地通過對耐UV輻射微生物的篩選獲得耐γ射線輻射微生物。

目前，耐UV輻射微生物的篩選主要通過菌株的UV輻照時間－存活特性來確定［11－13］。這一方法存在工作量大、時間長以及耗材多等缺點(diǎn)，僅適合對少量特殊耐輻射微生物的鑒定和抗輻射特性的研究使用，而對大量菌株的篩選較為困難。因此，本研究利用96孔板與菌液點(diǎn)板法，通過對各影響因素的分析和優(yōu)化，建立耐UV輻射微生物高通量篩選模型。

2 材料

（1）大腸桿菌 DH5α（E.coli DH5α）和耐輻射奇球菌（Deniococcus radiodurans）均為我所菌保室保存。

（2）培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 5g，純凈水1000mL，pH 7.0。TGY培養(yǎng)基：蛋白胨5g，酵母浸粉3g，葡萄糖2g，純凈水1000mL，pH 7.5。

3 方法

3.1 微生物的培養(yǎng)

從新鮮斜面刮取輻射敏感菌大腸桿菌DH5α（E.coli DH5α）一環(huán)，劃線接種至LB培養(yǎng)基平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)12h后取出備用。從上述新鮮培養(yǎng)物中，調(diào)取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、180r／min恒溫震蕩培養(yǎng)12h，菌液于5000r／min下離心5min后棄上清，菌體備用。

新鮮斜面刮取輻射抗性對照菌株D.radiodurans一環(huán)，劃線接種至TGY培養(yǎng)基平板上，置于30℃恒溫培養(yǎng)72h后取出備用。從上述新鮮培養(yǎng)物中，調(diào)取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，于30℃、180 r／min恒溫震蕩培養(yǎng)72h，菌液于5000r／min下離心5min后棄上清，菌體備用。

3.2 懸浮液及菌體濃度的選擇

分別選取0.05mol／L、pH值為7.2的磷酸緩沖液、生理鹽水、無菌水以及Biolog所使用的菌體懸浮液吉冷膠作為懸浮液，分別在200～400nm內(nèi)進(jìn)行波長－吸光度掃描。并將前面所述離心收集的菌體混勻，分別配置成不同的菌體濃度，將分光光度計樣品槽調(diào)至狹縫進(jìn)光后，于波長600nm下進(jìn)行樣品的時間－吸光度值進(jìn)行掃描，并記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

3.3 加樣位置對輻射效果的影響

分別吸取上述制得的菌懸液67μL，加樣于無菌96孔板的中心以及4個角，于超靜工作臺的15W紫外燈下，垂直距離30cm處進(jìn)行輻照，每間隔一定時間取樣2μL，并點(diǎn)樣于LB培養(yǎng)平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)12h后，觀察菌落形態(tài)的不同［14］。

3.4 菌體培養(yǎng)方式對輻射效果的影響

挑取前述菌種新鮮培養(yǎng)物一環(huán)至無菌0.02mol／L、pH 7.2的磷酸鉀緩沖液中，混勻并洗滌3次重懸后，吸取菌懸液加入無菌96孔板中，置于酶標(biāo)儀于600nm下測定OD值。通過分析測定菌液的OD值，對菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋至后備用。

分別吸取平板培養(yǎng)和液體培養(yǎng)制得的相同濃度菌懸液67μL加入于另一無菌96孔板中心，置于超靜工作臺的15W紫外燈下，垂直距離30cm處進(jìn)行輻照，每間隔一定時間取樣2μL，并點(diǎn)樣于LB培養(yǎng)平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)24h后，觀察菌落數(shù)量的不同。

3.5 輻照效果的驗證

分別以D.radiodurans和E.coli作為驗證菌株，收集液體培養(yǎng)基中新鮮培養(yǎng)的各菌的菌體，以用0.05 mol／L磷酸鉀緩沖液（pH 7.2）洗滌菌體3次，并調(diào)整至濃度0.5OD600。分別取10mL菌懸液置于9cm培養(yǎng)皿中，放置于15W紫外燈下30cm處，黑暗振蕩輻照處理［13］，每間隔一定時間取樣2μL，并點(diǎn)樣于LB培養(yǎng)平板上，置于30℃恒溫培養(yǎng)一定時間后，觀察菌落形態(tài)的不同，并對本研究建立的實(shí)驗方法進(jìn)行驗證。

4 結(jié)果與分析

4.1 輻射模型條件的確定

4.1.1 懸浮液的確定

在本實(shí)驗?zāi)Ｐ椭幸蚴褂?6孔板，無法進(jìn)行電磁攪拌。為了使在輻射過程中菌液相對均勻，本實(shí)驗對懸浮液和菌體濃度進(jìn)行了分析。實(shí)驗首先選取0.02 mol／L、pH 7.2的磷酸緩沖液、生理鹽水、無菌水以及biolog所使用的菌體懸浮液吉冷膠作為懸浮液，分別在200～400nm下進(jìn)行波長－吸光度掃描。實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)Biolog所使用的菌體懸浮液吉冷膠在200～250 nm范圍內(nèi)有明顯的吸收峰，因而不適合作為耐UV輻射菌篩選中的懸浮液（見圖1）。而磷酸緩沖液、生理鹽水、無菌水均無吸收，考慮實(shí)驗過程中菌體自身釋放的代謝物質(zhì)或因紫外輻射造成菌體物質(zhì)或代謝物質(zhì)的釋放造成pH的變化，因此本研究優(yōu)先使用0.02 mol／L、pH 7.2的磷酸緩沖液［12］。

4.1.2 菌懸液濃度的確定

目前文獻(xiàn)有關(guān)耐UV輻射菌的研究中為了使菌體在輻照時間內(nèi)保證菌液均一性，往往需要使用電磁攪拌器進(jìn)行攪拌［11－12］。在本實(shí)驗?zāi)Ｐ椭幸蚴褂玫臑?6孔板，無法進(jìn)行電磁攪拌。為了使在輻射過程中菌液相對的均勻，本實(shí)驗對懸浮液和菌體濃度進(jìn)行了分析。

圖1 10%吉冷膠的波長－吸光度掃描曲線

以D.radiodurans和E.coli為實(shí)驗菌，分別使用0.05mol／L磷酸緩沖液（pH 7.2）配置成0.5OD600和1.0OD600菌懸液，將分光光度計樣品槽調(diào)至狹縫進(jìn)光后，于波長600nm下進(jìn)行樣品的OD－時間掃描，并記錄數(shù)據(jù)（見圖2）。由圖2可以看出，在實(shí)驗時間內(nèi)，不同濃度的E.coli菌懸液，其上層吸光度幾乎不變。對于不同濃度的D.radiodurans菌懸液來說，1.0 OD600的菌懸液在靜置過程中上層吸光度會不斷降低，當(dāng)達(dá)到0.9OD600后下降趨勢變慢；而0.5OD600菌懸液在實(shí)驗過程中幾乎無變化，因此，選擇0.5OD600菌懸液為實(shí)驗菌體濃度。

圖2 不同懸浮液下菌體OD－時間的描曲線

另外，通過計算和測量常規(guī)UV輻射時10mL菌懸液置于9cm培養(yǎng)皿時菌液厚度，得到在96孔板條件下加67μL與菌液厚度相當(dāng)，并通過游標(biāo)卡尺測量數(shù)據(jù)一致，因此后續(xù)實(shí)驗菌液的加樣量取67μL。

4.1.3 加樣位置對輻射效果的影響

UV輻射的劑量率主要與紫外燈的功率、輻射距離有關(guān)。在紫外燈功率一定下，輻射劑量與輻射距離平方成反比?？紤]到當(dāng)96孔板至于燈管正下方且與燈管方向平行時，96孔板中心線與邊線與燈管距離的不同，可能帶來輻射效果的不同。實(shí)驗以輻射敏感菌E.coli為實(shí)驗菌，分別對96孔板的特殊位置，即4個角A1、A12、H1、H12及中心區(qū)域點(diǎn)E6分別加樣67 μL，于超靜工作臺下輻照一定時間后取樣2μL，并點(diǎn)樣于LB培養(yǎng)平板上，恒溫培養(yǎng)后觀察菌落數(shù)量的不同（見圖3）。由圖3可以看出，上述5個位置中樣品分別照射60s和75s后菌量數(shù)基本一致。

分析原因為，盡管邊線和中心線到燈管距離存在不同且成一定角度，經(jīng)計算邊線到紫外燈的距離為30.15cm，按劑量率與距離的平方計算，邊線的劑量率約為中心線的99.01%，如再考慮到燈管自身的直徑，劑量率相差將更小，因此在不同點(diǎn)上輻射結(jié)果類似，可以認(rèn)為在本實(shí)驗條件下，紫外燈照射在96孔板上每個孔的劑量率是相同的。

圖3 不同位置對紫外輻射效果的影響

4.1.4 菌體培養(yǎng)方式對輻射效果的影響

在常規(guī)UV輻射時，一般選擇使用液體搖瓶培養(yǎng)菌體到對數(shù)期后期收集菌體，通過洗滌和重懸后，進(jìn)行UV輻射。上述方法對于大量篩選耗時耗力，特別是在本模型中僅需少量菌體的情況下，尤顯耗材多。因此本實(shí)驗以輻射敏感菌E.coli為實(shí)驗菌，分別對液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)的菌體，菌體洗滌重懸后加入96孔板中進(jìn)行輻射，并以常規(guī)方法（液體培養(yǎng)）進(jìn)行輻射作為對照驗證，結(jié)果見圖4。由圖可以看出三者的結(jié)果一致。因此，在本模型中可利用平板或斜面培養(yǎng)的菌體進(jìn)行耐UV輻射菌的篩選。

圖4 不同培養(yǎng)方式對紫外輻射效果的影響

4.2 輻照效果的驗證

為了進(jìn)一步驗證模型的可靠性，分別以耐輻射菌D.radiodurans作為驗證菌株，收集菌株在平板上新鮮培養(yǎng)的菌體，以0.05mol／L磷酸鉀緩沖液（pH7.2）洗滌菌體3次，并調(diào)整至濃度0.5OD600，吸收67μL置于96孔板的孔中上樣。然后放置于15W紫外燈下30cm處，黑暗振蕩輻照處理，每間隔一定時間取樣2μL，并點(diǎn)樣于LB培養(yǎng)平板上，置于30℃恒溫培養(yǎng)一定時間后，觀察菌落形態(tài)的不同。同時，以傳統(tǒng)方法，即利用液體培養(yǎng)收集洗滌菌體，并配制相同濃度的菌懸液，分別取10mL菌懸液置于9cm培養(yǎng)皿中輻射作為對照，結(jié)果見圖5（圖中A為傳統(tǒng)方法，B為本模型方法）。由圖5可以看出，兩者結(jié)果一致，證明本模型具有可靠性。

圖5 基于D.radiodurans的模型驗證

4.3 耐UV菌的高通量篩選及進(jìn)一步的驗證

挑取從輻射污染地區(qū)及周邊分離出的96株細(xì)菌，分別制得相同濃度的菌懸液，以耐輻射菌D.radiodurans耐輻射劑量為參考，以UV輻射20min為處理時間，隨后取樣點(diǎn)板，并置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并觀察實(shí)驗結(jié)果。隨機(jī)挑取一株不產(chǎn)芽孢的耐UV輻射菌株，利用傳統(tǒng)方法進(jìn)行輻射存活率驗證，結(jié)果見圖6。由圖6可以看出，驗證菌株的確具有耐受20min的特性，因此也再一次證明模型的可行性。

圖6 菌株T93的耐UV輻射曲線

4.4 篩選模型的進(jìn)一步優(yōu)化

在利用前述的篩選模型條件下，實(shí)驗前期發(fā)現(xiàn)分離獲得大量的芽孢桿菌。通過實(shí)驗觀察，除芽孢桿菌自身營養(yǎng)體具有一定的耐UV輻射特性外，另與平板培養(yǎng)時間控制不當(dāng)、造成菌落大量產(chǎn)生芽孢有關(guān)。因為芽孢本身具有極強(qiáng)的抗紫外等抗逆性，造成實(shí)驗篩出結(jié)果偏高。因此在后續(xù)實(shí)驗操作過程，一方面可通過密切觀察相關(guān)菌種的生長情況，及時鏡檢避免上述情況。在實(shí)際操作中，一般選擇菌落形成不久即進(jìn)行輻射處理。另外，為了節(jié)約時間和工序，可單獨(dú)將產(chǎn)芽孢的菌株拿出，單獨(dú)進(jìn)行篩選。

由前期實(shí)驗可知，在前述模型下96孔板上紫外輻射劑量率近似均勻。實(shí)驗設(shè)計了一個簡單裝置（見圖7），即在原有的96孔板外層包裹了一層鋁箔紙，且鋁箔紙可以按實(shí)驗所需抽動。在同一菌株不同時間紫外照射時，可事先在實(shí)驗所需的孔中加入菌懸液，操作時只需每隔一定時間抽出一個孔的距離，待實(shí)驗結(jié)束后，可統(tǒng)一進(jìn)行點(diǎn)樣。其中最后一個未輻射樣為零時間處理，第1個樣為最長時間處理。用上述方法不僅進(jìn)行一步簡便了處理步驟，同時也減少了操作工序。

圖7 實(shí)驗?zāi)Ｐ退醚b置

5 結(jié)論

耐輻射微生物作為特殊環(huán)境微生物，與其相關(guān)的研究具有極其重要的意義，業(yè)已成為微生物學(xué)研究熱點(diǎn)之一。針對耐輻射微生物的耐γ射線輻射特性和耐UV輻射特性的相關(guān)性，及傳統(tǒng)耐UV輻射微生物篩選費(fèi)時、費(fèi)力和費(fèi)材的缺點(diǎn)，設(shè)計了一種基于96孔板的高通量篩選方法。通過不同菌的實(shí)驗驗證，及該模型篩選菌的耐UV特性研究表明，該模型方便可行，為高通量篩選耐UV輻射菌的篩選提供了可能。

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