溫針灸對嗎啡戒斷大鼠腦區(qū)CREBmRNA表達的影響*

衛(wèi) 哲，董 哲，王 威

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150001;2.哈爾濱市兒童醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150010)

嗎啡濫用給全世界帶來了巨大損害，對嗎啡成癮后的戒毒治療已成為醫(yī)學界研究的熱點。針灸治療具有安全、可靠、副作用少等優(yōu)點，已被廣大患者認可，并很快得到推廣應用［1］。溫針灸能激發(fā)經(jīng)氣，促進周身氣血流動，抗御外邪，使臟腑失調(diào)的功能趨于平衡。目前，關(guān)于溫針灸改善大鼠戒斷癥狀方面的研究尚不多見。本實驗通過觀察溫針灸對減輕大鼠戒斷癥狀的作用以及腦內(nèi)環(huán)腺苷酸反應元件結(jié)合蛋白(cAMP Yesponse element binding protein，CREB)mRNA 的表達，探討其對戒斷后中樞的影響機制。

1 材料

1.1 動物

SD大鼠(黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供)，40只，雄性，體重(190±30)g。動物在實驗前進行適應性馴養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑和藥品

鹽酸嗎啡注射液(沈陽第一制藥廠，批號20080802);鹽酸納絡(luò)酮注射液(成都倍特藥業(yè)有限公司，批號20081103);逆轉(zhuǎn)錄酶AMV(Pormgea公司);Taq酶(上海生工)。

1.3 主要儀器與設(shè)備

AB－160型電子分析天平(山西太原航空航天工業(yè)部太行儀表廠)、ABI7500熒光定量PCR擴增儀(美國PerkinElme公司)等。

2 實驗方法

2.1 動物分組

將40只大鼠隨機分為對照組、模型組、溫針灸組、手針組，每組10只。

2.2 造模方法

根據(jù)相關(guān)文獻資料［2］進行造模，采用逐日遞增法，在背部皮下注射鹽酸嗎啡注射液，劑量分別為20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg、50 mg/kg，每天2次(8 am、4 pm)，連續(xù)5天。于最后注射后3 h進行納絡(luò)酮戒斷，用量為3 mg/kg，隨后觀察10 min內(nèi)大鼠的戒斷反應，將符合評分者作為模型動物。評分結(jié)果見表1。

表1 各組嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀評分比較(±s)

表1 各組嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀評分比較(±s)

注:與對照組相比，△P ＜0.05。

0.3 ±0.48模型組 20.5 ±4.16△溫針灸組 19.4 ±4.92△手針組 20.6 ±6.81組別 戒斷總分對照組△

表1示，對照組以外的各組大鼠出現(xiàn)不同程度的戒斷癥狀，并且與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，表明成功建立嗎啡戒斷大鼠模型。

2.3 各組處理

對照組與嗎啡注射者以相同時間、方法注射生理鹽水，第6天開始每日四肢捆綁固定。模型組按上述方法造模，第6天開始每日四肢捆綁固定。溫針灸組于第6天開始進行溫針灸治療，取百會、雙側(cè)腎俞、三陰交、足三里，針刺得氣后，在針尾上搓捏少許艾絨點燃施灸，只待燃盡，除去灰燼，留針稍許再將針拔出，共計留針15 min，治療6天。手針組于第6天開始予針刺治療，取穴方法同溫針灸組，得氣后留針15 min。

2.4 取材

治療結(jié)束后的第二天將大鼠以戊巴比妥麻醉后開胸，固定液進行灌注固定，開顱，完整取出全腦組織，分離伏隔核(NAc)，液氮保存。

2.5 檢測大鼠腦區(qū)CREB基因的表達

以Real－time PCR法進行檢測。取300 mg組織樣放置于－80℃保存的研缽中，倒入液氮，快速研磨，裝入5 ml離心管中。加入4.5 ml Trizol提取液。室溫溫育5 min，12 000 rpm 離心10 min，取上清，加1 ml氯仿并離心15 min。移上清后加3 ml異丙醇混勻并放置，再次離心 10 min。棄上清，加 75%乙醇并7 500 rpm離心5 min。棄乙醇，干燥，加 DEPC－treat溶解總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄［3－4］。具體操作過程按照試劑盒說明書進行。

2.6結(jié)果分析

選擇β－action為內(nèi)參，以SDS7000軟件獲得各樣本的Ct值，通過2－△△Ct計算CREB相對mRNA表達水平。表達差別倍數(shù)以2－△△Ct表示。

2.7 統(tǒng)計學處理

由SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

大鼠NAc腦區(qū)CREBmRNA表達的變化，見表2。

表2 大鼠NAc腦區(qū)CREBmRNA的表達(±s，n=10，ng/L)

表2 大鼠NAc腦區(qū)CREBmRNA的表達(±s，n=10，ng/L)

注:與模型組比較，△P ＜0.05;與手針組比較，▲P ＜0.05。

組別 CT(CREB) CT(action) 2－ΔΔCT對照組 25.18 ±0.14 17.57 ±0.2 0.078(－0.156 －0.304)模型組 24.79 ±0.1820.91 ±0.22 1.0(0.91 －1.09)溫針灸組 24.5 ±0.15 18.32 ±0.09 0.199(0.008 －0.388)△▲手針組 23.99 ±0.1419.24 ±0.31 0.648(0.477 －0.817)△

由表2所示，與模型組比較，溫針灸組、手針組的腦區(qū)CREBmRNA表達明顯降低，差異有顯著性意義(P＜0.05)。與手針組比較，溫針灸組腦區(qū)CREBmRNA表達降低，差異有顯著性(P＜0.05)，說明針灸治療可以調(diào)整大鼠戒斷后CREBmRNA的表達，以溫針灸對CREBmRNA表達改善為著。

4 討論

本實驗通過不同的針灸方法對嗎啡成癮后大鼠的戒斷癥狀進行治療，結(jié)果顯示，溫針灸能夠減輕大鼠戒斷癥狀，并且明顯降低大鼠腦區(qū)的CREBmRNA表達(P＜0.05)，認為其參與了嗎啡成癮后戒斷的中樞調(diào)節(jié)機制。

反復給藥不但會出現(xiàn)一系列的成癮表現(xiàn)，還會出現(xiàn)腦功能的長時程變化，并且出現(xiàn)基因表達調(diào)節(jié)改變［5］。一般認為，基因表達的關(guān)鍵是基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，CREB轉(zhuǎn)錄因子家族調(diào)控多種基因的表達，在AC－cAMP系統(tǒng)的上調(diào)中似乎起關(guān)鍵作用，這可能是自身內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制發(fā)揮作用的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，NAc不僅參與調(diào)控急性強化效應，同時介導嗎啡依賴形成過程中長時程適應的改變［6］。

研究發(fā)現(xiàn)［7］，CREB在不同的神經(jīng)元內(nèi)調(diào)節(jié)不同目標基因，也可能是調(diào)節(jié)不同神經(jīng)元產(chǎn)生相同的效應，但是最后的行為學效應不同。CREB能夠參與調(diào)節(jié)行為記憶，并且起到關(guān)鍵作用。但相對來講，CREB活性是短暫的，例如，慢性給藥后CREB活性在藥物撤退后幾天內(nèi)就恢復正常水平，這意味著這種長時轉(zhuǎn)變可能啟動與成癮和記憶有關(guān)的更加穩(wěn)定的行為改變，比如通過其他基因的調(diào)節(jié)，提示還應有其他因子參與［7－8］。

本實驗初步分析溫針灸對大鼠戒斷癥狀的影響，其作用除了調(diào)節(jié)腦區(qū)CREB基因表達之外，還存在對其它多種基因的影響，針灸戒毒有很大的應用前景，還有待于進一步探討其中樞作用機制。

［1］舒榮，文秀英，茹立強.國內(nèi)外針灸戒毒研究進展［J］.中國針灸，2003，23(2):121 －125

［2］紀家濤，王新華，由振東，等.嗎啡依賴大鼠模型的建立［J］.第二軍醫(yī)大學學報，1997，18(1):81 －82

［3］曾俊杰，孫凱，吳承堂，等.應用實時熒光定量PCR檢測結(jié)直腸癌與癌旁組織中 miRNA－221的差異表達狀況［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(12):26 －28

［4］鄒湘輝，莊東紅，吳云影，等.實時熒光定量PCR檢測小鼠腦組織中3－羥基丁酸受體基因PUMA－G的轉(zhuǎn)錄表達［J］.廣東醫(yī)學，2010，31(1):58 －60

［5］衛(wèi)哲.電針對嗎啡戒斷后大鼠中樞谷氨酸－多巴胺動機環(huán)路作用機制的研究［D］.哈爾濱:黑龍江中醫(yī)藥大學，2011

［6］Hawes JJ，Narasimhaiah R，Picciotto MR.Calanin attenuates cyclic AMP regulatry element－binding protein(CREB)phosphorylation induced by chronic morphine and naloxon chanlleng in Cath.a cell and primary striatal cultures［J］.J Neurochem.2006，96:1160 －1168

［7］Berke JD，Hyman SE.Addiction，dopamine and the molecular mechanisms of memory［J］.Neuron，2000，25，515 －532

［8］Blendy JA，Maldonado R.Genetic analysis of drug addiction:The role of cAMP response element binding protein［J］.Journal of Molecular Medicine，1998，76，104 －110