百草枯致SD大鼠中毒生理研究

劉傳志，汪路涵，王越，趙天闊，侯玥

（長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022）

百草枯化學(xué)名稱是1-1-二甲基-4-4-聯(lián)吡啶陽離子鹽，是一種快速滅生性除草劑，對(duì)人毒性極大，一般LD50為20mg/kg，且無特效解藥。市面上多為百草枯20%紫藍(lán)色溶液，此類產(chǎn)品成人致死量為5-15ml/kg[1]。目前，國內(nèi)外對(duì)于百草枯的致病機(jī)理尚不明確，而且沒有有效降低毒性的治療手段[2-4]。雖然我國已對(duì)百草枯的生產(chǎn)做出控制和銷售資質(zhì)的管理，但每年仍有因百草枯或其類似物而中毒的患者，出現(xiàn)嚴(yán)重的病發(fā)癥甚至危及生命。因此，研究百草枯導(dǎo)致臟器損傷的機(jī)制就顯得十分重要?，F(xiàn)有證據(jù)表明百草枯對(duì)身體各個(gè)臟器都有毒性，其毒性是通過產(chǎn)生自由基而導(dǎo)致破壞作用的[5-7]。

前人有報(bào)道稱百草枯毒性的主要靶器官是肺，是依賴多胺攝取系統(tǒng)積聚濃度，發(fā)生氧化還原循環(huán)途徑產(chǎn)生大量促氧化劑反應(yīng)性物質(zhì)[8，9]。由于在肺泡中I、II型細(xì)胞和細(xì)支氣管細(xì)胞膜上多胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的大量表達(dá)，肺組織的百草枯濃度要比血漿高出6-10倍。造成肺纖維化，使肌成纖維細(xì)胞（MFb）活化增生[10，11]，進(jìn)一步導(dǎo)致肺表面活性劑系統(tǒng)的功能異常所致。同時(shí)巨噬細(xì)胞釋放炎性因子如：TNF-α、IL、IFN-γ、磷脂酶（PLA2）等。使巨噬細(xì)胞發(fā)生組織內(nèi)聚、親潤、活化，自由基釋放增加，正反饋性加劇組織損傷。Takeyama等人[12]用人肺上皮樣細(xì)胞系L123進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)百草枯可導(dǎo)致DNA細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，組織細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，線粒體內(nèi)膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成線粒體功能障礙，并能誘導(dǎo)體外肺細(xì)胞A549肌動(dòng)蛋白骨架破壞，膜通透性改變，線粒體內(nèi)膜異常去極化，解偶聯(lián)和基質(zhì)腫脹造成細(xì)胞凋亡。同時(shí)百草枯對(duì)細(xì)胞通路還有很大的影響，絲裂素活化蛋白激酶（MAPKs）通路、核因子κB（NF-κB）通路、氧化應(yīng)激反應(yīng)等。臨床上誤服百草枯可導(dǎo)致口腔、舌咽及胃、食道粘膜糜爛潰瘍，有時(shí)還伴有發(fā)熱嘔吐、呼吸困難等表現(xiàn)。本文旨在探究不同劑量百草枯對(duì)大鼠血液各項(xiàng)指標(biāo)的影響以及對(duì)大鼠各臟器器官的病變狀況，借此分析百草枯對(duì)大鼠的生理性毒性和免疫功能的損傷，為進(jìn)一步揭示百草枯或其類似物的致毒機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備

SD大鼠購于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，編號(hào)2017000185550。6-7周雌性，共20只，分為4組，每組5只，第5組為對(duì)照組。標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，給水充足，飼養(yǎng)在長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物房。

百草枯溶液：1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.1mg/mL的各100ml。每日晚18時(shí)向?qū)嶒?yàn)組大鼠分別灌胃劑量為：0.1mg、0.5mg、1.0mg的百草枯，連續(xù)灌胃7天，同時(shí)向?qū)φ战M灌胃等計(jì)量的生理鹽水。

1.2 儀器及耗材

百草枯（江蘇省南京市紅太陽生物化學(xué)有限責(zé)任公司）、Leica石蠟切片機(jī)（德國 1850 UV）、FV1000型Olympus激光共聚焦顯微鏡、5810R型低溫高速離心機(jī)、HH-501A型超級(jí)恒溫水浴、LR40型制冰機(jī)、CX31-12C02型Olympus顯微鏡、多聚甲醛、無水乙醇、明膠、蘇木素、二甲苯、Tunel染色試劑盒（碧云天 C1086）、血常規(guī)使用全自動(dòng)血液分析儀和EDTA抗凝采血管（長春理工大學(xué)校醫(yī)院）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠懸尾實(shí)驗(yàn)

將大鼠移入實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)30min，在大鼠尾端膠帶固定，使大鼠頭向下懸掛，并注意避免機(jī)械性損傷，懸掛臺(tái)使大鼠離桌面30cm的懸掛點(diǎn)，由觀察者分別記錄各組大鼠的放棄掙扎時(shí)間，并記錄數(shù)據(jù)平均值用于統(tǒng)計(jì)。用于統(tǒng)計(jì)百草枯對(duì)大鼠情緒抑郁性狀態(tài)、比較大鼠體能變化，揭示藥物對(duì)大鼠的行為活動(dòng)造成的影響。數(shù)據(jù)采用mean±SD表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 大鼠血常規(guī)

大鼠采用心臟穿刺采血，儲(chǔ)存于EDTA抗凝采血管內(nèi)，將收集到的各組大鼠血液標(biāo)記，充分混勻后，送至校醫(yī)院分析化驗(yàn)。各項(xiàng)數(shù)據(jù)以mean±SD表示，各組間的差異顯著性采用SPSS 13.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析SD大鼠常見血液學(xué)檢測(cè)指標(biāo)參考范圍參照文獻(xiàn)[12].

2.3 大鼠臟器檢測(cè)

取實(shí)驗(yàn)組SD大鼠肺、腎、肝、脾處器官檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，將取出的組織，剪切成2×2×2mm3的小塊，經(jīng)放置于多聚甲醛浸泡48h，樣本浸泡流水沖洗30分鐘去除組織中的固定液。然后浸泡在50%、75%、無水乙醇脫水。包埋樣品托上涂一層OCT包埋膠，4℃冰箱預(yù)冷5min，讓OCT膠浸透組織。樣品速凍架速凍，組織置于樣品托上，其上再添一層OCT膠，冷凍30min。恒溫冰凍切片機(jī)切片，切薄片至6-8μm。切片時(shí)，低溫室內(nèi)溫度以-15℃～-20℃為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組織切片。切好室溫放置30min后，晾干。PBS溶液洗5min×3。封閉BSA蛋白、進(jìn)行Tunel染色，顯微鏡觀察，分析取樣組織器官的細(xì)胞凋亡情況，借以評(píng)估百草枯中毒致大鼠肺、腎、肝、脾器官損傷情況。

3 結(jié)果與討論

3.1 大鼠懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將連續(xù)7天灌胃有百草枯的大鼠進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)觀察，計(jì)時(shí)6min后停止，對(duì)大鼠后4min的不動(dòng)時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。不動(dòng)時(shí)間最短的是1組，即對(duì)照組，為（35.0±3.2）s，不動(dòng)時(shí)間最長的是第三組為（165.0±19.2）s。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：百草枯使得大鼠明顯虛弱，且濃度越大的藥液造成的損傷更為嚴(yán)重，引發(fā)大鼠體力下降，情緒低落，興奮性降低。且在對(duì)SD大鼠觀察中發(fā)現(xiàn)高濃度給藥組大鼠呼吸劇烈，胸腔起伏明顯。這提示百草枯可能對(duì)大鼠肺部造成損傷。

表1 大鼠懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2 大鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果

將連續(xù)7天灌胃有百草枯的大鼠，心臟穿刺采血，送至校醫(yī)院進(jìn)行血常規(guī)檢驗(yàn)。隨著灌胃百草枯溶液的濃度和劑量的加大，其中白細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)的下降、淋巴細(xì)胞增加表明機(jī)體免疫功能遭到損害，伴有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，大鼠腹腔內(nèi)積液較多，胸腔水腫并有渾濁腔液，尤其以1.0mg/D組最為明顯。

表2 SD大鼠血常規(guī)檢測(cè)主要部分指標(biāo)（第三組）

3.3 大鼠臟器檢測(cè)結(jié)果

將連續(xù)7天灌胃有百草枯的大鼠，取大鼠肺、肝、腎、脾等組織，冰凍切片處理，進(jìn)行Tunel染色，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)采用碘化丙啶（propidine iodide，PI）核酸染料，不能透過完整的細(xì)胞膜，在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。生凋細(xì)胞，基因組DNA開始斷裂，暴露的3'末端羥基，可以在脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化下加上綠色熒光探針熒光素（FITC）標(biāo)記的dUTP。

圖1 第三組肺凋亡染色結(jié)果

圖2 第一組肺凋亡染色結(jié)果

圖3 第三組肝凋亡染色結(jié)果

圖4 第一組肝凋亡染色結(jié)果

圖5 第三組脾調(diào)亡染色結(jié)果

圖6 第一組脾凋亡染色結(jié)果

圖7 第三組腎凋亡染色結(jié)果

圖8 第一組腎凋亡染色結(jié)果

從上述凋亡染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：第三組，大鼠肺臟出現(xiàn)大量的死亡細(xì)胞，而凋亡的細(xì)胞相對(duì)較少，但卻有大量的細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)。在肝臟、脾、腎等臟器的IHC檢測(cè)中，在高劑量百草枯實(shí)驗(yàn)組中都發(fā)現(xiàn)有較多的細(xì)胞發(fā)生死亡，且肝細(xì)胞凋亡損傷較重。第一組低劑量百草枯大鼠肺細(xì)胞僅有部分死亡，且損傷相對(duì)較輕，但在肝、脾、腎等臟器細(xì)胞損傷大致相當(dāng)，表明低劑量的百草枯對(duì)大鼠臟器有一定的傷害作用?？傊B續(xù)七天灌胃1.0mg劑量的百草枯對(duì)大鼠肺部造成嚴(yán)重?fù)p害，其它臟器也損傷較重。連續(xù)七天灌胃0.1mg劑量的百草枯對(duì)肺部就能誘發(fā)肺細(xì)胞的凋亡，對(duì)肝、脾、腎等亦有不同程度傷害。

4 結(jié)論

本文采用連續(xù)七天不同濃度的百草枯溶液灌胃大鼠，構(gòu)建百草枯中毒大鼠模型。通過大鼠懸尾實(shí)驗(yàn)、血常規(guī)檢驗(yàn)、IHC組織切片實(shí)驗(yàn)，分析百草枯對(duì)大鼠制毒機(jī)制。實(shí)驗(yàn)表明連續(xù)七天灌胃1.0mg劑量百草枯大鼠體能下降嚴(yán)重，情緒抑郁，飲食量和活動(dòng)性減少，對(duì)外界刺激敏感度下降。血常規(guī)分析血紅細(xì)胞含量增多，血紅蛋白增加，免疫相關(guān)細(xì)胞增多，提示大鼠免疫應(yīng)答劇烈，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。IHC組織切片凋亡染色發(fā)現(xiàn)高劑量百草枯對(duì)大鼠肺部造成極其嚴(yán)重的損害，肺細(xì)胞大量死亡，幾乎全部肺內(nèi)組織發(fā)生細(xì)胞死亡，這與懸尾實(shí)驗(yàn)中第三組大鼠體力下降，呼吸急促相符，這一結(jié)果與前人研究相一致。同時(shí)高劑量百草枯對(duì)肝、脾、腎臟也產(chǎn)生了影響，出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。提示百草枯對(duì)大鼠肺細(xì)胞有明顯的致死性，對(duì)肝、腎、脾等組織也有不同程度的損害。在0.1mg的劑量下可對(duì)大鼠造成不可逆性的傷害。綜上所述，通過對(duì)大鼠灌胃百草枯農(nóng)藥，對(duì)其生理特征的研究提示，一旦誤服百草枯農(nóng)藥，必須立即洗胃灌腸導(dǎo)泄持續(xù)胃腸減壓，吸出胃液殘留毒物，藥物對(duì)肺部損傷將會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的后果，中毒嚴(yán)重者只能換血或者肺纖維化后切除。針對(duì)百草枯對(duì)肺細(xì)胞的損傷，探究其損傷機(jī)制和代謝類型，開發(fā)相關(guān)抑制劑性藥物或解毒制劑，將是未來主要研究方向。