芹菜素與核酸作用機制的研究＊

郭 蒙，高慶宇，馬艷麗，王 曉，李麗敏

（1.中國礦業(yè)大學(xué)，江蘇 徐州 221116；2.濰坊學(xué)院，山東 濰坊 261061）

芹菜素（apigenin，API）又名洋芹素、芹黃素，具有抗腫瘤及化療增敏作用、抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、對組織、對器官及系統(tǒng)具有保護(hù)作用等藥理作用［1－2］。核酸（DNA）是組成基因的主要部分，與藥物小分子等物質(zhì)產(chǎn)生作用后，會導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)與功能不同程度的變化，因此，研究DNA與小分子物質(zhì)的作用在藥學(xué)、醫(yī)學(xué)及生物學(xué)等領(lǐng)域具有相當(dāng)重要的意義［3－5］。目前研究DNA作用機制的研究主要采用熒光光譜、紫外光譜、電化學(xué)、粘度等方法［6－9］，對于黃酮類化合物和DNA間相互作用的研究已有報道［10］，但對于芹菜素與DNA相互作用的研究尚未見相關(guān)報道。本文通過電化學(xué)法、紫外－可見分光光度法等探索研究了芹菜素與fsDNA之間的作用方式，并對芹菜素與fsDNA之間的結(jié)合數(shù)、結(jié)合常數(shù)進(jìn)行了研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI－660電化學(xué)工作站（上海辰華）；TU－1810紫外可見吸收分光光度計（北京普析）；pHS－3BW酸度計（上海理達(dá)）；0.5－0.6mm烏氏粘度計（上海申立）；fsDNA（Sigma公司）；芹菜素（南京澤朗）；其他所用試劑均為分析純或生物純，實驗用水為去離子水經(jīng)二次重蒸而得。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的熱變性處理

將一定量的DNA溶液在沸水浴中煮沸30min，然后迅速放在0℃的冰水浴中冷卻，即可得到熱變性的DNA（ssDNA）。

1.2.2 電化學(xué)方法

電極預(yù)處理：金電極先在2000目的金相砂紙上仔細(xì)研磨，再在麂皮上依次用0.3um、0.05umAl2O3粉末和2次重蒸水的懸糊拋光成鏡面，并用1∶1乙醇溶液和二次重蒸水超聲清洗，干燥后作為工作電極使用；飽和甘汞電極作參比電極，鉑絲作為對電極。

在一系列10mL的比色管中，依次加入一定量的HMTA溶液、API溶液、fsDNA溶液，定容搖勻，穩(wěn)定15min。以試劑空白作參比，在10mL電解池中、在－0.1～0.5V電位范圍內(nèi)，采用三電極系統(tǒng)，用循環(huán)伏安法（CV）或方波伏安法（SUV）以100mV／s的掃描速度掃描，分別記錄I～v曲線。

1.2.3 紫外－可見分光光度法

將按上述方法配置好的溶液置于比色皿中，以0.011mol／l的HMTA溶液作參比，分別在240～600nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 電化學(xué)方法

對于一些具有電化學(xué)活性的物質(zhì)，可用循環(huán)伏安法來判斷DNA與小分子物質(zhì)之間的作用方式，如果加入DNA后，氧化峰電位負(fù)移，證明DNA與小分子物質(zhì)之間存在靜電作用；若加入DNA后，氧化峰電位正移，則兩者之間是以嵌入作用相結(jié)合的［11－12］。芹菜素與fsDNA相互作用的循環(huán)伏安圖如圖1所示。

圖1 芹菜素與fsDNA相互作用的循環(huán)伏安圖

由圖1可見，在0.2V～1.3V的電位范圍內(nèi)，DNA并沒有出現(xiàn)特征的氧化還原峰，而芹菜素則在0.966V處出現(xiàn)了一個非常明顯的氧化峰，并在0.508V處出現(xiàn)了還原峰，兩峰之間的峰電位差ΔE＝0.458V，說明芹菜素在金電極上發(fā)生了準(zhǔn)可逆的氧化還原反應(yīng)。當(dāng)加入fsDNA后，氧化峰電位發(fā)生了負(fù)移（0.966v→0.946v），說明二者之間的作用不可能為嵌入作用，而可能為靜電作用；同時也說明二者之間通過這種作用生成了一種新的物質(zhì)。

·發(fā)現(xiàn)地震產(chǎn)生的地面運動一般隨至斷層距離的增大而減小，并根據(jù)近地表物質(zhì)的特性以及局部結(jié)構(gòu)（如深大盆地）而變化。

同樣的現(xiàn)象在芹菜素與fsDNA的方波伏安圖中表現(xiàn)的更為明顯（圖2）。從圖2中可以看出，單獨的芹菜素在0.2～1.3V電位范圍內(nèi)僅在1.072V處有微弱的峰電流（ΔIp＝－1.391×10－6A），加入fsDNA后，峰電位發(fā)生了負(fù)移，由1.072V移動到0.924V，并且峰電流出現(xiàn)了顯著增強（從－1.391×10－6A增強到－7.777×10－6A），說明二者之間發(fā)生了作用，生成了一種電活性較高的復(fù)合物。

圖2 芹菜素與fsDNA的方波伏安圖

圖3 芹菜素與DNA相互作用的紫外－可見吸收光譜圖

2.2 紫外－可見分光光度法

圖3為芹菜素與DNA相互作用的紫外－可見吸收光譜圖。由圖3可知，在240nm到450nm范圍內(nèi)，芹菜素分別在323.5nm、291nm處出現(xiàn)了兩個特征吸收峰，當(dāng)加入fsDNA后，芹菜素的紫外－可見吸收峰發(fā)生了明顯的變化，說明兩者發(fā)生了作用，并且隨著fsDNA濃度的增加，在323.5nm處吸收峰的峰位置基本不變，吸光度略微增大，但另一個吸收峰的峰位置發(fā)生了較大變化，最大吸收波長由287.5nm紫移到266.5nm，相應(yīng)的吸光度由0.409增大到0.86。通常認(rèn)為吸收峰紅移、發(fā)生減色效應(yīng)為嵌入作用［3］，而本實驗加入fsDNA后，導(dǎo)致芹菜素的吸收峰紫移，并且產(chǎn)生了增色效應(yīng)，說明兩者之間存在的作用為靜電作用。

2.3 鹽效應(yīng)和磷酸鹽效應(yīng)

通常小分子物質(zhì)與DNA以靜電作用或溝槽作用結(jié)合時，由于加入的電解質(zhì)與小分子物質(zhì)競爭，導(dǎo)致小分子物質(zhì)與DNA相互作用程度降低，對ΔIp的影響較大；而以嵌入方式作用時，因小分子物質(zhì)插到DNA的堿基對中，由于堿基的位阻作用，ΔIp的變化不大［13］。分別向芹菜素、fsDNA溶液中，加入不同濃度的NaCl溶液作用20min，用循環(huán)伏安法以100mV／s的掃描速度掃描，研究NaCl對芹菜素與fsDNA相互作用的影響，結(jié)果見圖4。由圖可見，氧化峰電流差值ΔIp先隨NaCl濃度的增大出現(xiàn)略微升高，當(dāng)NaCl濃度大于0.015時，ΔIp出現(xiàn)急劇的下降，進(jìn)一步證明芹菜素與fsDNA之間是以靜電作用結(jié)合在一起的。

圖4 氧化峰電流差值隨Nacl濃度的變化曲線

圖5 氧化峰電流差值隨Na2HPO4濃度的變化曲線

因為Na2HPO4中含有磷酸根，可與fsDNA中帶負(fù)電的磷酸根基團(tuán)競爭與芹菜素的結(jié)合，如果它們之間為靜電作用，則會對峰電流影響很大。分別向含有芹菜素、fsDNA的溶液中加入不同濃度的Na2HPO4溶液作用20min，并用循環(huán)伏安法以100mV／s的掃描速度掃描，結(jié)果見圖5。從圖5可知，Na2HPO4溶液的加入對芹菜素的氧化峰電流差值ΔIp影響較大，說明Na2HPO4中的磷酸根與fsDNA之間發(fā)生了競爭，降低了fsDNA與芹菜素的結(jié)合，導(dǎo)致峰電流降低，進(jìn)一步證明二者之間存在靜電作用。

2.4 結(jié)合數(shù)與結(jié)合常數(shù)的測定

［14－15］計算芹菜素與fsDNA相互作用的結(jié)合數(shù)m和結(jié)合常數(shù)K。假定芹菜素與fsDNA只形成一種簡單的復(fù)合物fsDNA－API，則可推出如下公式：

由斜率和截距可求得結(jié)合數(shù)m＝4.31872≈4，表明fsDNA和芹菜素相互作用后形成1∶4型的分子結(jié)合物，由截距求得其結(jié)合常數(shù)K＝1.31×104L／mol。

3 結(jié)論

本文通過電化學(xué)法、紫外－可見光譜法研究了芹菜素和fsDNA之間的作用方式，研究發(fā)現(xiàn)，二者之間的作用方式是靜電作用，這在鹽效應(yīng)、磷酸鹽效應(yīng)的實驗中得到進(jìn)一步證明。芹菜素和fsDNA之間通過靜電力結(jié)合并生成了一種電活性較高的復(fù)合物。同時求得fsDNA與芹菜素的結(jié)合數(shù)是4，結(jié)合常數(shù)K＝1.31×104L／mol。

參考文獻(xiàn)：

［1］沈映君.中藥藥理學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：200.

［2］王海娣，劉艾林，杜冠華.芹菜素藥理作用的研究進(jìn)展［J］.中國新藥雜志，2008，17（18）：1561－1565.

［3］Kumar C V，Asuncion E H.Sequence dependent energy transfer from DNA to a simple aromatic chromophore［J］.J Am Chem Soc 1992，（6）：470－472.

［4］郭蒙，楊景和，吳霞，等.蘆?。|－核酸體系的熒光增強效應(yīng)及其分析應(yīng)用的研究［J］.化學(xué)試劑，2009，31（2）：81－85.

［5］吳會靈，楊原，張重杰，等.小分子與核酸相互作用的研究進(jìn)展［J］.分析化學(xué)，2004，32（9）：1256－1261.

［6］Jia Z，Yang J H，Wu X，et al.The sensitive determination of nucleic acids using resonance light scattering quenching method［J］.Spectrochim Acta，2006，64A（3）：555－559.

［7］童曉青，呂鑒泉，孫娟.熒光及吸收光譜法研究B－環(huán)糊精－硫堇包合物與DNA的相互作用［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2007，27（12），2538－2541.

［8］廖鈁，艾珍，朱清濤.酵母核糖核酸與中性紅相互作用及電化學(xué)檢測［J］.分析測試學(xué)報，2007，26（6），869－872.

［9］王桂芬，李海南，李春哲.嗪草酮與脫氧核糖核酸相互作用的研究［J］.分析化學(xué)，2006，34（8），1165－1168.

［10］屈凌波，趙俊宏，李建軍.木犀草素與 DNA相互作用的電化學(xué)研究［J］.分析測試學(xué)報，2008，27（1）：79－83.

［11］Wang L，Bai J Y，Huang P F，et al.Self－assembly of gold nanoparticles for the voltammetric sensing of epinephrine［J］.Electrochem Commun，2006，8（6）：1035－1040.

［12］Erkila K E，Odom D T，Barton J K.Recognition and reaction of metallointercalators with DNA［J］.Chem Rev，1999，99：2777－2796.

［13］Erdem A，Kerman K，Meric B.Novel hybridization indicator methylene blue for the electrochemical detection of short DNA sequences related to the hepatitis B virus［J］.Anal Chin Acta，2000，422：139.

［14］Qu F，Li N Q，Jiang Y Y.Electrochemical studies of porphyrin in interacting with DNA and determination of DNA［J］.Anal Chin Acta，1997，344：97.

［15］Laviron E.General expression of the linearpotential sweep voltammogram in the case of diffusionless electrochemical systems［J］.Electronical Chemical，1979，101（1）：19－28.