微波協(xié)同酶法提取金針菇多糖工藝的優(yōu)化

黃 瓊 丁 玲

（福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350007）

金針菇（Flammulina velutipes）擔(dān)子菌目金錢菌屬，富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)、維生素和粗纖維，含脂肪較低，具有很好的藥用價值［1］。金針菇多糖 （Flammulina velutipes polysaccharides，F(xiàn)VP）是金針菇的主要活性成分之一，具有增強(qiáng)記憶力、抗疲勞；抗腫瘤，提高機(jī)體免疫力；抗衰老，抗有害藥物對機(jī)體損害的作用［2］。

微波提取法因其具有高效性，操作簡便，得率高，產(chǎn)物易于純化等特點已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提?。?－5］，而酶作用于金針菇真菌細(xì)胞，使金針菇真菌細(xì)胞壁破裂，促進(jìn)多糖的溶出，提高了多糖的得率。多糖的提取，目前主要有水提醇析法、微波法、超聲波法等［6，7］，但微波協(xié)同酶法提取金針菇多糖工藝鮮見報道，近年研究［8－10］表明微波協(xié)同酶法可顯著提高多糖的提取率。因此，本試驗采用微波協(xié)同酶法提取金針菇多糖，旨在為金針菇多糖的進(jìn)一步純化和活性研究奠定基礎(chǔ)，同時也為金針菇保健食品的開發(fā)提供一條新的工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料

金針菇子實體干粉：福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食用菌基地提供新鮮金針菇，自然曬干1d，60℃烘干至恒重，機(jī)械粉碎后過60目篩得。

1.1.2 試劑

果膠酶、纖維素酶：酶活力≥105U／g，西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；

葡萄糖、苯酚、濃硫酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計：TU－1221型，北京普析通用儀器公司；

精密pH計：PHSJ－3F型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE－52A型，上海天呈科技有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：LGR10－4.2型，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 酶解法單因素試驗設(shè)計方案

（1）果膠酶濃度的影響：精確稱取金針菇子實體干粉放入燒杯中，加入3倍質(zhì)量體積的蒸餾水提取，設(shè)果膠酶濃度分別為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5% （m∶m），酶解溫度為40℃，酶解時間為1.0h，pH值為4.0。提取液經(jīng)離心、真空濃縮、4倍80%乙醇沉淀、真空抽濾、恒溫干燥得金針菇粗多糖。以多糖得率為指標(biāo)，考察果膠酶濃度對金針菇多糖得率的影響。

（2）pH值的影響：精確稱取金針菇子實體干粉放入燒杯中，加入3倍質(zhì)量體積的蒸餾水提取，設(shè)果膠酶濃度為0.4% （m∶m），pH 值分別為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，酶解溫度為40℃，酶解時間為1.0h。提取液經(jīng)離心、真空濃縮、4倍80%乙醇沉淀、真空抽濾、恒溫干燥得金針菇粗多糖。以多糖得率為指標(biāo)，考察pH值對金針菇多糖得率的影響。

（3）酶解溫度的影響：精確稱取金針菇子實體干粉放入燒杯中，加入3倍質(zhì)量體積的蒸餾水提取，設(shè)果膠酶濃度為0.4% （m∶m），pH 值為4.0，酶解溫度分別為35，40，45，50，55℃，酶解時間為1.0h。提取液經(jīng)離心、真空濃縮、4倍80%乙醇沉淀、真空抽濾、恒溫干燥得金針菇粗多糖。以多糖得率為指標(biāo)，考察酶解溫度對金針菇多糖得率的影響。

（4）酶解時間的影響：精確稱取金針菇子實體干粉放入燒杯中，加入3倍質(zhì)量體積的蒸餾水提取，設(shè)果膠酶濃度為0.4% （m∶m），pH值為4.0，酶解溫度為45℃，酶解時間分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5h。提取液經(jīng)離心、真空濃縮、4倍80%乙醇沉淀、真空抽濾、恒溫干燥得金針菇粗多糖。以多糖得率為指標(biāo)，考察酶解時間對金針菇多糖得率的影響。

1.2.2 微波協(xié)同酶法單因素試驗設(shè)計方案

（1）微波功率對金針菇多糖得率的影響：精確稱取金針菇子實體干粉放入燒杯中，加入3倍質(zhì)量體積的蒸餾水，按酶解最佳工藝條件進(jìn)行提取，后微波提取，設(shè)微波功率分別為150，300，450，600，750W，料液比為1∶20（m∶V），提取時間為60s的條件下提取1次，提取液經(jīng)離心、真空濃縮、4倍80%乙醇沉淀、真空抽濾、恒溫干燥得金針菇粗多糖。以多糖得率為指標(biāo)，考察微波功率對金針菇多糖得率的影響。

（2）料液比對金針菇多糖得率的影響：精確稱取金針菇子實體干粉放入燒杯中，加入3倍質(zhì)量體積的蒸餾水，按酶解最佳工藝條件進(jìn)行提取，后微波提取，設(shè)微波功率為600W，分別設(shè)料液比為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（m∶V），提取時間為60s的條件下提取1次，提取液經(jīng)離心、真空濃縮、4倍80%乙醇沉淀、真空抽濾、恒溫干燥得金針菇粗多糖。以多糖得率為指標(biāo)，考察料液比對金針菇多糖得率的影響。

（3）提取時間對金針菇多糖得率的影響：精確稱取金針菇子實體干粉放入燒杯中，加入3倍質(zhì)量體積的蒸餾水，按酶解最佳工藝條件進(jìn)行提取，后微波提取，設(shè)微波功率為600W，料液比為1∶20（m∶V），分別設(shè)提取時間為45，60，75，90，105，120s的條件下提取1次，提取液經(jīng)離心、真空濃縮、4倍80%乙醇沉淀、真空抽濾、恒溫干燥得金針菇粗多糖。以多糖得率為指標(biāo)，考察提取時間對金針菇多糖得率的影響。

（4）提取次數(shù)對金針菇多糖得率的影響：精確稱取金針菇子實體干粉放入燒杯中，加入3倍質(zhì)量體積的蒸餾水，按酶解最佳工藝條件進(jìn)行提取，后微波提取，設(shè)微波功率為600W，料液比為1∶20（m∶V），提取時間為90s的條件下，分別微波提取1，2，3，4次，以多糖得率為指標(biāo)，考察提取次數(shù)對金針菇多糖得率的影響。

1.2.3 金針菇多糖得率 參照文獻(xiàn)［10］按式（1）計算多糖得率：

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件的優(yōu)化

2.1.1 不同酶對金針菇多糖得率的影響 精確稱取金針菇子實體干粉放入燒杯中，加入3倍質(zhì)量體積的蒸餾水進(jìn)行提取，設(shè)定酶解溫度為40℃，分別加入0.20%（m∶m）的纖維素酶、0.20% （m∶m）的果膠酶、0.10% （m∶m）的纖維素酶和0.10%（m∶m）果膠酶的復(fù)合酶，調(diào)節(jié)溶液pH為4.5，酶解1.0h。提取液經(jīng)離心、真空濃縮、4倍80%乙醇沉淀、真空抽濾、恒溫干燥得金針菇粗多糖。并與不加酶作對比，以多糖得率為指標(biāo)，考察不同酶對金針菇多糖得率的影響，所有試驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取平均值，結(jié)果見圖1。

圖1 不同酶的加入量對金針菇多糖得率的影響Figure 1 Effect of the different enzyme concentration on the yield of polysaccharide

由圖1可知，采用酶法提取，金針菇多糖得率顯著提高。其中用0.20%（m∶m）的果膠酶提取，金針菇多糖得率最高。其原因是果膠酶能破壞組織間質(zhì)中的胞間連結(jié)構(gòu)，有效地促使各種化學(xué)物質(zhì)從植物組織中釋放出來，從而減少沉淀增加多糖得率。因此，選定果膠酶來提取金針菇多糖。

2.1.2 酶解最佳工藝條件的確定 在單因素試驗基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗，優(yōu)化提取工藝。選擇對多糖得率影響較大的4個因素（果膠酶濃度、pH值、酶解溫度和酶解時間）設(shè)計L9（34）正交試驗，所有試驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取平均值，正交試驗因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 酶解正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Orthogonal test results of extraction

由表2可知，對金針菇多糖得率影響的主次順序依次為果膠酶濃度（A）＞酶解溫度（C）＞pH值（B）＞酶解時間（D）。最優(yōu)因素水平組合為A3B2C2D2，即酶解溫度45℃，酶解時間1.5h，調(diào)節(jié)溶液pH 4.0，加入0.40% （m∶m）果膠酶為酶解最佳工藝條件。

2.1.3 驗證實驗 由表2可知，最佳方案為A3B2C2D2，而正交表中沒有該組合方案，為了進(jìn)一步考察酶解提取工藝條件的準(zhǔn)確性，按照最優(yōu)組合A3B2C2D2進(jìn)行3次重復(fù)實驗，取平均值，在最佳條件下金針菇多糖得率為17.26%。

2.2 微波協(xié)同酶法最佳工藝條件的確定

在單因素試驗基礎(chǔ)上，對微波功率、料液比、提取時間和提取次數(shù)4個因素進(jìn)行正交試驗，以確定最佳提取工藝參數(shù)，并考察各因素對金針菇多糖得率影響的主次順序。所有試驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取平均值，正交試驗因素水平見表3，結(jié)果見表4。

表3 因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal test

表4 微波提取正交試驗結(jié)果與分析Table 4 Orthogonal test results of extraction

由表4可知，對多糖得率影響因素大小依次為微波功率（A）＞料液比（C）＞ 提取次數(shù)（D）＞提取時間（B）。試驗結(jié)果較好的方案為A3B2C1D3，且表中試驗號為8的試驗結(jié)果即金針菇多糖得率最高，也驗證了此因素水平組合為最佳提取工藝條件。因此，微波協(xié)同酶法提取金針菇多糖的最佳工藝組合為酶解溫度45℃，加入0.40%（m∶m）果膠酶，調(diào)節(jié)溶液pH為4.0，酶解時間1.5h，微波功率600W，料液比1∶20（m∶V），提取時間90s，提取3次。在最佳條件下，金針菇多糖得率為21.76%。

3 結(jié)論

（1）采用微波協(xié)同酶法新技術(shù)提取金針菇多糖明顯優(yōu)于傳統(tǒng)提取法。一方面，微波加熱具有高效性，能深入滲透細(xì)胞，快速升高溫度，使其溶解出更多的金針菇多糖提高其得率，且顯著縮短提取時間，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。另一方面，果膠酶破壞組織間質(zhì)中的胞間連結(jié)構(gòu)，多糖易從細(xì)胞內(nèi)釋放出來，提高了多糖得率。因此，應(yīng)用微波協(xié)同酶法提取工藝較大程度地提高金針菇多糖得率。

（2）微波協(xié)同酶法提取金針菇多糖的最佳提取工藝條件為酶解溫度45℃，加入0.40%（m∶m）果膠酶，溶液pH 4.0，酶解時間1.5h，微波功率為600W，料液比1∶20（m∶V），提取時間90s，提取3次，在最佳條件下，微波協(xié)同酶法的得率為21.76%，與單一的微波法（7.81%）相比，提高了13.95%。與酶解法（17.26%）相比，提高了4.50%。

1 Leung M Y K，F(xiàn)ung K P，Choy Y M.The isolation and characterization of an immunomodulatory and anti－tumor polysaccharide preparation fromFlammulina velutipes［J］.Immun Pharmacology，1997，35（3）：255～263.

2 王大紅，劉明華.金針菇多糖提取條件的優(yōu)化［J］.武漢職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2009（5）：76～80.

3 黃瓊，陳嬋，彭宏，等.微波法萃取紫色甘薯皮原花青素工藝的研究［J］.食品科技，2010，35（4）：199～203.

4 文春娟，陳祥貴，饒鳳，等.微波輔助提取石榴皮多酚工藝研究［J］.食品與機(jī)械，2011，27（6）：103～106.

5 劉曉麗，鐘少樞，于泓鵬，等.微波法和水蒸餾法提取丁香精油的研究［J］.食品與機(jī)械，2012，28（4）：110～112.

6 李世敏，劉冬.金針菇多糖提取新工藝的優(yōu)化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，28（10）：45～48.

7 李志洲，楊海濤，閔鎮(zhèn)田.金針菇多糖最佳提取工藝研究［J］.寶雞文理學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2003，23（1）：39～41.

8 趙玉，徐雅琴.微波協(xié)同酶法提取南瓜多糖最佳提取條件的研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，30（1）：221～223.

9 陳紅，張艷榮，王大為.微波協(xié)同酶法提取玉米須多糖工藝的優(yōu)化研究［J］.食品科學(xué)，2010，31（10）：41～44.

10 朱彩平，肖智敏.微波協(xié)同酶法提取平菇柄多糖的工藝研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2011，23（1）：118～122.