分段調(diào)控優(yōu)化阿維拉霉素生產(chǎn)菌罐上發(fā)酵參數(shù)

潛媛媛 陳 敏 王 宏

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310012；2.浙江凱勝生物藥業(yè)有限公司，浙江 蘭溪 321100）

阿維拉霉素又名卑霉素、阿美拉霉素、肥拉霉素［1］，既是一種抗生素又是一種新型的消化促進(jìn)劑和代謝調(diào)節(jié)劑［2］，主要抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，對(duì)革蘭氏陰性菌效果較差［3］。阿維拉霉素作為飼料添加劑，具有結(jié)構(gòu)獨(dú)特、安全性高、毒性小、低殘留等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用在禽畜飼料中。目前阿維拉霉素僅由美國(guó)禮來(lái)公司生產(chǎn)，并且受專利保護(hù)。國(guó)內(nèi)外對(duì)阿維拉霉素罐上發(fā)酵的研究較少，多數(shù)通過(guò)優(yōu)化搖瓶發(fā)酵工藝以提高阿維拉霉素產(chǎn)量［4－6］，且鮮少有對(duì)阿維拉霉素的罐上發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行分段調(diào)控的研究。

阿維拉霉素是綠色產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces viridoehrongenes）的次級(jí)代謝產(chǎn)物，一般在菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期后期或穩(wěn)定期合成。本試驗(yàn)擬以阿維拉霉素生產(chǎn)菌Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株為研究對(duì)象，通過(guò)分段調(diào)控并結(jié)合正交試驗(yàn)對(duì)其罐上發(fā)酵過(guò)程中的溫度、pH等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，旨在提高該菌株罐上發(fā)酵合成阿維拉霉素的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

綠色產(chǎn)色鏈霉菌 （Streptomyces viridoehrongenes）N－0104：浙江凱勝生物藥業(yè)有限公司；

藤黃微球菌 （Microccus luteus）10209：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

全溫振蕩培養(yǎng)箱：HZ－F160型，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；

發(fā)酵罐：BIOTECH－2002型，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：YXQ－LS－75Ⅱ型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

可見(jiàn)分光光度計(jì)：JH721型，上海菁華科技儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱：SHP－250型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；多功能微生物自動(dòng)測(cè)量分析儀：ZY－300IV型，北京先驅(qū)威鋒科技開(kāi)發(fā)公司；

pH計(jì)：DELTA 320型，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑

活化 培 養(yǎng) 基 （g／L）：可 溶 性 淀 粉 20.0，KNO31.0，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，瓊脂20.0，pH 7.2～7.4。

種子培養(yǎng)基（%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：黃豆餅粉1.5，酵母粉0.25，葡萄糖0.5，糊精2.0，氯化鈣1.8，碳酸鈣0.1，pH 6.4～6.7。

發(fā)酵培養(yǎng)基（%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：葡萄糖1.8，黃豆餅粉1.3，精制豆油1.0，氯化鈣1.8，碳酸鈣0.5，氯化鈉0.1，硝酸鈉0.45，氯化錳0.005，七水硫酸亞鐵0.005，硫酸鎂0.005，硫酸鋅0.005，硫酸銅0.001，硫酸鈷0.001，硫酸銨0.2，玉米淀粉4.0，消泡劑0.03，pH 6.6～6.9。

檢定培養(yǎng)基（g／L）：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，瓊脂20.0，pH 7.0～7.2。

阿維拉霉素預(yù)混劑：10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），美國(guó)禮來(lái)公司。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 用接種鏟取1cm×1cm的單菌落菌種塊，接入裝有100mL種子培養(yǎng)基的1 000mL錐形瓶中，28℃、200r／min條件下培養(yǎng)48h。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

（1）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：按10%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量取種子培養(yǎng)液，在無(wú)菌條件下接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，28℃、200r／min條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，并在培養(yǎng)了24h時(shí)補(bǔ)加0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的L－纈氨酸。

（2）罐上發(fā)酵培養(yǎng)：按10%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量在裝有7L發(fā)酵培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中接入種子培養(yǎng)液，在28℃，通氣量1∶1，溶氧30%，罐壓0.03～0.05MPa下培養(yǎng)一定時(shí)間，并在培養(yǎng)了24h時(shí)補(bǔ)加0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）L－纈氨酸。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 pH的測(cè)定 取10mL培養(yǎng)一定時(shí)間的發(fā)酵液，搖勻后在pH計(jì)上直接讀數(shù)。

1.3.2 菌體濃度的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［7］測(cè)定。

1.3.3 還原糖和總糖的測(cè)定 采用 DNS法［8］。

1.3.4 氨態(tài)氮的測(cè)定 采用甲醛滴定法［9］。

1.3.5 阿維拉霉素含量的測(cè)定 采用微生物檢定法［10］。

1.4 罐上發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)

1.4.1 變溫發(fā)酵條件優(yōu)化 根據(jù)Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株搖瓶生長(zhǎng)曲線確定菌種的搖瓶發(fā)酵生長(zhǎng)期和阿維拉霉素合成期，設(shè)計(jì)菌株生長(zhǎng)期溫度和阿維拉霉素合成期溫度的2因素3水平正交試驗(yàn)，通過(guò)搖瓶變溫發(fā)酵確定最優(yōu)組合。然后進(jìn)行Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株罐上變溫發(fā)酵驗(yàn)證，并對(duì)菌株罐上變溫發(fā)酵與恒溫發(fā)酵的阿維拉霉素產(chǎn)量進(jìn)行比較。

1.4.2 罐上發(fā)酵pH調(diào)控 阿維拉霉素生產(chǎn)菌的菌體生長(zhǎng)較適pH為7.0～7.2，所以培養(yǎng)基滅菌后pH調(diào)在7.1左右［7］。而由于堿性條件下有利于阿維拉霉素生產(chǎn)菌產(chǎn)素，所以在菌體后期阿維拉霉素合成期分別控制pH在7.5，8.0，8.5，進(jìn)行比較選擇 Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株后期阿維拉霉素合成的最適pH。

2 結(jié)果與分析

2.1 變溫發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 搖瓶發(fā)酵生長(zhǎng)曲線 按1.2.2中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法進(jìn)行Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株的搖瓶發(fā)酵。考察菌株搖瓶發(fā)酵過(guò)程各代謝參數(shù)的變化，結(jié)果見(jiàn)圖1、2。

圖1 搖瓶培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基pH及還原糖變化曲線Figure 1 Time course of pH and reducing sugar of medium in 250mL－triangle flasks

圖2 搖瓶培養(yǎng)條件下菌體濃度及效價(jià)變化曲線Figure 2 Time course of cell volume and titer in 250mL－triangle flasks

由圖2菌體濃度－時(shí)間曲線可知，搖瓶發(fā)酵前期菌體生長(zhǎng)速度快，菌體濃度快速增加。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，菌體濃度增加的速度變慢。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入后期時(shí)，由于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分不足造成菌體自溶，菌體濃度下降。由效價(jià)－時(shí)間曲線可知，0～4d主要為菌體的生長(zhǎng)期，阿維拉霉素合成很少。4d之后阿維拉霉素效價(jià)上升速度加快，阿維拉霉素不斷積累。9d之后阿維拉霉素產(chǎn)量變化很小，其中10d時(shí)達(dá)到最大 值 700.14mg／L。 可 以 確 定 Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株的搖瓶發(fā)酵周期為10d，其中0～4d為菌體生長(zhǎng)期，5～10d為菌體阿維拉霉素合成期。

2.1.2 搖瓶變溫發(fā)酵試驗(yàn) 由文獻(xiàn)［7］和［11］可知，阿維拉霉素生產(chǎn)菌的培養(yǎng)溫度一般為28℃，故以28℃為中心點(diǎn)，設(shè)計(jì)Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株搖瓶變溫發(fā)酵的2因素3水平正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表2及表3。

由表2可知，因素A對(duì)于菌體濃度來(lái)說(shuō)是主要因素，對(duì)于效價(jià)來(lái)說(shuō)是次要因素，但是對(duì)于兩個(gè)指標(biāo)來(lái)說(shuō)都是以A2為最佳水平，選取A2。因素B對(duì)于效價(jià)來(lái)說(shuō)是主要因素，對(duì)于菌體濃度來(lái)說(shuō)是次要因素，根據(jù)在確定某個(gè)因素的水平時(shí)首先應(yīng)選擇該因素作為主要因素的優(yōu)水平的原則［12］，選取B1。由表3可知，因素A與B對(duì)菌體濃度有影響，因素A與B對(duì)效價(jià)有高度顯著的影響。最終變溫發(fā)酵的條件為生長(zhǎng)期溫度28℃，阿維拉霉素合成期溫度25℃，在該條件下?lián)u瓶發(fā)酵阿維拉霉素的效價(jià)為820.83mg／L。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test／℃

表2 變溫發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test of changing temperature fermentation

表3 變溫發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表?Table 3 Variance analysis of orthogonal test of changing temperature fermentation

2.1.3 罐上變溫發(fā)酵驗(yàn)證 按1.2.2中的罐上發(fā)酵培養(yǎng)方法進(jìn)行Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株的罐上變溫發(fā)酵，其中發(fā)酵溫度根據(jù)生長(zhǎng)期28℃，阿維拉霉素合成期25℃進(jìn)行分段調(diào)控?？疾炀旯奚献儨匕l(fā)酵過(guò)程各代謝參數(shù)的變化，結(jié)果見(jiàn)圖3、4。

由圖3pH－時(shí)間曲線可知，發(fā)酵前期，Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌體生長(zhǎng)，消耗培養(yǎng)基內(nèi)的速效碳源，分解糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生酸、醇等小分子物質(zhì)，使得發(fā)酵初期pH下降。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，培養(yǎng)基中糖逐漸缺乏，pH開(kāi)始上升。在2～4d，由于培養(yǎng)基中的氮源被分解利用后產(chǎn)生NH3，所以在糖代謝和氮代謝的綜合作用下，pH迅速上升。之后菌絲體大量積累，代謝產(chǎn)物的合成速度加快，而由于碳酸鈣的存在，pH的變化很小。

圖3 罐上變溫發(fā)酵培養(yǎng)基pH及還原糖變化曲線Figure 3 Time course of pH and reducing sugar in a 10Lfermenter

由還原糖－時(shí)間曲線可知，發(fā)酵初期由于菌體生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)合成酶分解淀粉，使得發(fā)酵液中還原糖含量出現(xiàn)略有升高的現(xiàn)象。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵液中還原糖含量呈下降的趨勢(shì)。發(fā)酵前期，發(fā)酵液中還原糖含量下降速度快。第4天之后，發(fā)酵液中還原糖含量接近15mg／mL。隨著發(fā)酵過(guò)程進(jìn)入后期，發(fā)酵液中還原糖含量下降的趨勢(shì)變得緩慢，發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液中還原糖的含量為8.79mg／mL。

圖4 罐上變溫發(fā)酵菌體濃度及效價(jià)變化曲線Figure 4 Time course of cell volume and titer in a 10Lfermenter

由圖4菌體濃度－時(shí)間曲線可知，10L發(fā)酵罐罐上發(fā)酵過(guò)程中，菌體在發(fā)酵前期生長(zhǎng)旺盛，菌體濃度增加速度快。發(fā)酵時(shí)間達(dá)到4d之后菌體濃度增加速度變慢，所以第4天之后發(fā)酵溫度調(diào)至25℃。而發(fā)酵10d之后由于發(fā)酵罐中培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分不足，菌體開(kāi)始自溶，菌體濃度也略有下降。

由效價(jià)－時(shí)間曲線可知，0～4d主要為菌體的生長(zhǎng)期，只有很少量的阿維拉霉素合成。4d之后開(kāi)始進(jìn)入阿維拉霉素合成期，此時(shí)發(fā)酵溫度為25℃，菌體合成阿維拉霉素速度快，阿維拉霉素不斷積累。8d之后發(fā)酵液中阿維拉霉素產(chǎn)量增加緩慢。第10、11天時(shí)阿維拉霉素產(chǎn)量為960mg／L左右，并且變化很小，說(shuō)明此時(shí)阿維拉霉素產(chǎn)量已達(dá)到最大值。因此 確 定 Streptomyces viridoehrongenes N－0104 菌 株 的10L發(fā)酵罐罐上變溫發(fā)酵周期為10d，其中0～4d為菌體生長(zhǎng)期，5～10d為菌體阿維拉霉素合成期。

2.1.4 罐上變溫發(fā)酵與恒溫發(fā)酵比較 將2.1.3中的Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株罐上變溫發(fā)酵阿維拉霉素產(chǎn)量與菌株罐上恒溫發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，當(dāng)Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株進(jìn)行罐上恒溫發(fā)酵時(shí)，在第11、12天時(shí)阿維拉霉素產(chǎn)量變化已經(jīng)很小，達(dá)到最大值735.27mg／L，可以確定菌株罐上恒溫發(fā)酵的周期為11d。當(dāng)菌株進(jìn)行罐上變溫發(fā)酵時(shí)，第10、11天時(shí)阿維拉霉素產(chǎn)量沒(méi)有明顯差異，達(dá)到最大值963.28mg／L，比恒溫發(fā)酵的產(chǎn)量提高了31.01%，并且菌株罐上變溫發(fā)酵的周期為10d。說(shuō)明罐上變溫發(fā)酵不僅能促進(jìn)菌株合成阿維拉霉素，而且能縮短菌株的發(fā)酵周期。

圖5 恒溫發(fā)酵與變溫發(fā)酵結(jié)果比較Figure 5 Comparison of variable temperature fermentation result and constant temperature fermentation result

2.2 罐上發(fā)酵pH調(diào)控

pH值的大小不僅會(huì)影響發(fā)酵過(guò)程中酶的活性，還會(huì)影響培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分和中間代謝產(chǎn)物的解離程度，從而影響到菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成等。在Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株罐上變溫發(fā)酵過(guò)程中，在控制培養(yǎng)基滅菌后pH為7.1左右的基礎(chǔ)上，對(duì)菌體阿維拉霉素合成期的pH進(jìn)行聯(lián)動(dòng)調(diào)控，并以不進(jìn)行pH調(diào)控的發(fā)酵為對(duì)照組，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 pH對(duì)產(chǎn)阿維拉霉素的影響Figure 6 Influence of pH on avilamycin production

由圖6可知，當(dāng)調(diào)控合成期pH為7.5時(shí)，Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株產(chǎn)阿維拉霉素的產(chǎn)量最高，為1 087.40mg／L，比對(duì)照組的產(chǎn)量（963.28mg／L）提高了12.89%。雖然堿性條件有利于阿維拉霉素的合成，但是當(dāng)調(diào)控阿維拉霉素合成期pH在8.0和8.5時(shí)，由于一定程度上影響到發(fā)酵過(guò)程中一些前體物質(zhì)的合成及酶的活性，所以阿維拉霉素的產(chǎn)量相對(duì)降低。

3 結(jié)論與討論

阿維拉霉素產(chǎn)生菌的發(fā)酵過(guò)程可以分為前期的生長(zhǎng)期和后期的阿維拉霉素合成期，因此本試驗(yàn)通過(guò)分段調(diào)控，并結(jié)合正交試驗(yàn)對(duì) Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株罐上發(fā)酵過(guò)程中的溫度、pH等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)微生物檢定法測(cè)定，采用優(yōu)化后的罐上發(fā)酵條件所得的阿維拉霉素產(chǎn)量為1 087.40mg／L，較初始的產(chǎn)量（735.27mg／mL）提高了47.89%。說(shuō)明阿維拉霉素產(chǎn)生菌罐上發(fā)酵分段調(diào)控能有效地提高阿維拉霉素的產(chǎn)量，這對(duì)阿維拉霉素的產(chǎn)業(yè)化具有很重要的意義。

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