大鼠妊娠前后吸入七氟烷對仔鼠海馬NMDA受體表達的影響

王宇恒，成永霞，艾春雨，孫曉峰，焦晶華，趙宏，王俊科

(1.沈陽醫(yī)學院奉天醫(yī)院麻醉科，遼寧 沈陽 110024;2.牡丹江醫(yī)學院病理學教研室;3.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院麻醉科)

隨著兒科和產(chǎn)科手術的發(fā)展，手術的復雜程度和持續(xù)時間都日益增加，吸入全麻藥被越來越多的應用于產(chǎn)科和兒科的鎮(zhèn)靜和麻醉。但是近來的研究卻證實，這些藥物對處于特殊發(fā)育期的動物大腦有神經(jīng)毒性作用，且這種毒性作用可引起致青春期和成年期的行為學改變。為降低麻醉風險，探討吸入麻醉藥對發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)的影響很有必要，且對長期暴露于吸入麻醉藥的孕期的手術室工作人員亦具有一定的意義。N－甲基－D－天冬氨酸受體 (N－methyl－D－asparate receptor，NMDAR)是皮層、海馬等腦區(qū)廣泛存在的與學習和記憶密切相關的一種受體，在人腦發(fā)育期神經(jīng)元網(wǎng)絡的建立中發(fā)揮了重要的作用［1］。有研究結果提示高位中樞的NMDAR參與了七氟烷鎮(zhèn)痛作用的調(diào)制過程。本研究觀察大鼠妊娠前后吸入2.4%七氟烷對仔鼠海馬NMDAR的影響，旨在說明妊娠前后吸入七氟烷是否會影響實驗動物神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育，從而產(chǎn)生遠期可塑性的變化，進而影響智力發(fā)育和行為學變化。

1 材料與方法

1.1動物及分組 雌性SD大鼠3月齡，體重250～300 g，雄性SD大鼠體重450～500 g(中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供)，實驗藥物七氟烷為美國百特國際 (Baxter)有限公司生產(chǎn) (批號S062G761)。雌性SD大鼠隨機分為3組：對照組(C組)，妊娠前吸入七氟烷組 (BS組)，妊娠期吸入七氟烷組 (PS組)。

1.2 動物分組后處理 C組、PS組自由進食水，各組雌鼠分別以雌雄2∶1比例與雄鼠合籠過夜。BS組于妊娠前吸入2.4%七氟烷6 h，于100%純氧中復蘇后，于當晚以雌雄2∶1比例與雄鼠合籠過夜。各組雌鼠于次日清晨8時檢查陰道涂片，以涂片查到精子定為妊娠0天。確定為懷孕的雌鼠單獨分籠喂養(yǎng)。孕鼠分娩后，保持每只雌鼠至少哺育8只仔鼠。PS組在確定妊娠后，于妊娠6、10、14和18 d分別吸入2.4%七氟烷，左心室穿刺取動脈血0.3 ml做血氣分析。免疫熒光和RT－PCR檢測各組仔鼠出生當天(T1)、出生后第7天 (T2)、出生后第14天 (T3)、出生后第28天 (T4)海馬NMDAR(NR1、NR2A、NR2B)的表達，從每只母鼠哺育的仔鼠中隨機抽取2只仔鼠，使每組包含12只仔鼠。

1.3 仔鼠海馬中NMDAR的免疫熒光檢測 1∶100稀釋的兔抗大鼠各指標的IgG抗體NR1抗體、NR2A抗體、NR2B抗體 (武漢博士德公司產(chǎn)品)，滴加試劑盒中提供的羊抗兔FITC熒光二抗，室溫下孵育，封片，避光保存。在熒光顯微鏡 (IX71 Model，OLYMPUS，日本)下觀察各指標免疫熒光結果，使用圖像采集系統(tǒng) (BX41 Model，OLYMPUS，日本)，采集各指標免疫熒光圖像。顯微圖像 分 析 系 統(tǒng) (MetaMorph/C－5050/BX40model，UIC，USA;OLYMPUS，日本)，檢測各指標積分光密度值 (IOD值)。

1.4 仔鼠海馬中NMDAR的RT－PCR檢測 引物序列設計 (上海生工生物工程技術服務有限公司)：NR1 F：5'－TCGCATCATCTCAAACCAGAC－3'R：5－CTCATCT CTAGCCAGGTCTA－3';NR2A F：5'－TTGTTCCCCAAGAGTTTGCTT－3'R：5'－ACTCCACACTGCCCATGAAC－3';NR2B F：5'－TCCAGTTCCTGCAGGGAGTT－3'R：5'－GTTTGATGAAATCGAGCTGGC－3'。兩步法 RT－PCR：依據(jù) TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒 (大連寶生物公司產(chǎn)品)提供說明書進行操作KODAKID型凝膠成像，凝膠成像獲取的圖片用 Image Lab軟件進行分析，以 NR1、NR2A和NR2B的灰度值與GAPDH灰度值的比值反映NR1 mRNA，NR2A mRNA和NR2B mRNA的表達。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件，正態(tài)分布計量資料以 (±s)表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

各組隨機血氣分析各項指標均在正常范圍內(nèi)，且組間比較差異無顯著性，見表1。

表1 3組仔鼠血氣分析值比較 (n=6，±s)

表1 3組仔鼠血氣分析值比較 (n=6，±s)

組別pHPaCO2(mmHg)PaO2(mmHg)HCO－3(mmol/L)SaO2(%)T(℃)C組 7.45±0.05 35.7±2.9 94.0±9.2 24.5±3.5 96.0±3.0 37.0±0.3 BS組 7.40±0.07 39.7±7.0 87.0±6.0 28.2±4.0 95.0±3.1 37.1±0.4 PS組 7.38±0.04 38.5±2.9 89.0±7.0 26.0±3.4 94.0±2.0 36.9±0.3

免疫熒光結果提示：與C組相比，BS組仔鼠海馬NMDAR表達差異無顯著性 (P＞0.05);PS組仔鼠T1～T3時NR1和NR2A的表達明顯增強(P＜0.01)，NR2B表達顯著降低 (P＜0.01);T4時NMDAR表達差異無顯著性，見表2。

表2 3組仔鼠海馬NR1、NR2A及NR2B表達的比較 (n=12，±s)

表2 3組仔鼠海馬NR1、NR2A及NR2B表達的比較 (n=12，±s)

注：與C組比較，1)P＜0.01

組別NR1 NR2A NR2B T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 C組 40.8±2.8 42.4±1.8 43.5±2.4 44.2±2.2 49.3±4.2 53.9±1.3 53.8±1.7 54.2±2.1 30.0±3.1 31.2±1.9 30.6±2.9 33.4±2.3 BS組 41.50±2.943.9±2.2 44.3±2.7 43.9±2.2 51.5±3.0 55.3±2.0 55.1±3.9 53.9±2.1 31.4±2.9 30.0±2.3 31.1±2.0 32.7±1.9 PS組 49.4±2.51)49.0±2.01)51.1±1.91)42.8±2.3 61.0±2.71)61.5±2.41)61.1±2.01)53.0±2.2 27.4±1.71)27.8±1.41)28.9±2.71)31.8±3.8

RT－PCR結果顯示：與C組相比，BS組仔鼠海馬NMDAR mRNA表達差異無顯著性 (P＞0.05);PS組仔鼠T1～T3時NR1 mRNA和NR2A mRNA表達增強 (P＜0.01)，NR2B mRNA表達降低 (P＜0.01)，T4時NMDAR mRNA表達差異無顯著性，見表3。

表3 3組仔鼠海馬NR1 mRNA、NR2A mRNA、NR2B mRNA表達的比較 (n=12，±s)

表3 3組仔鼠海馬NR1 mRNA、NR2A mRNA、NR2B mRNA表達的比較 (n=12，±s)

注：與C組比較，1)P＜0.01

組別NR1 mRNA NR2A mRNA NR2B mRNA T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 C組 0.863±0.031 0.714±0.024 0.702±0.014 0.678±0.029 0.790±0.026 0.801±0.052 0.744±0.050 0.753±0.074 1.159±0.061 1.130±0.040 1.064±0.019 1.104±0.033 BS組 0.829±0.044 0.707±0.022 0.734±0.023 0.672±0.018 0.766±0.038 0.764±0.044 0.772±0.052 0.741±0.070 1.123±0.085 1.103±0.044 1.049±0.051 1.069±0.064 PS組 0.944±0.0461)0.887±0.0821)0.892±0.0431) 0.653±0.027 0.928±0.0621)0.904±0.0411)0.951±0.0241) 0.712±0.049 0.921±0.0541)0.776±0.0871)0.818±0.0441)1.113±0.021

3 討論

具有發(fā)育毒性的外來化合物與發(fā)育中的胚胎或胎仔接觸，可因胚胎或胎仔所處的發(fā)育階段不同而呈現(xiàn)不同的敏感性。在胚胎發(fā)育后期和新生兒期，最容易表現(xiàn)的發(fā)育毒性是生長遲緩和神經(jīng)、內(nèi)分泌以及免疫系統(tǒng)機能的改變。在常用實驗動物中，自受精日計算，大鼠器官發(fā)生期約為9～17 d，大鼠著床前胚泡形成期，自受精日計算，約為3～4 d，開始著床日約為5.5～6 d。本實驗使用的出生0、7、14、28 d的仔鼠相當于新生兒期、兒童期和青年期。本實驗將母體大鼠于妊娠前或妊娠6、10、14、18 d吸入1.6%的異氟烷或2.4%七氟烷，經(jīng)血氣分析結果證實，排除了由于其它原因如缺氧，酸中毒等導致的仔鼠腦發(fā)育異常，成功建立了大鼠吸入麻醉藥模型。

吸入麻醉藥以一種可逆的和劑量依賴性的方式抑制NMDAR。NMDAR在學習記憶、神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起著重要的作用［2－3］。未成熟大腦的快速發(fā)育期即突觸形成期，NMDAR被短暫阻滯后，多個重要腦區(qū)神經(jīng)元凋亡增加。出生前后NMDAR亞基表達的進行性變化對發(fā)育期突觸塑型起到了重要作用。氯胺酮可引起前腦皮層區(qū)神經(jīng)元凋亡發(fā)生增加，并伴隨著NR1表達上調(diào)和NR1 mRNA表達的增加［4－6］。新生大鼠注射NMDAR拮抗劑后，大鼠皮質、海馬及齒狀回 NR2A受體都有所增加［7］。Tang［8］發(fā)現(xiàn)NR2B高表達的轉基因小鼠具有超常的學習與記憶能力，在多種行為學測試中表現(xiàn)出良好的學習記憶成績，從而提出NR2B與大腦的認知密切相關，并將NR2B命名為“聰明基因”，提出該基因就是記憶基因的論斷。

本實驗結果表明，母體妊娠6、10、14、18 d吸入2.4%七氟烷6 h，可使仔鼠0、7、14 d海馬NR1、NR2A和NR1 mRNA、NR2A mRNA表達增多，NR2B和NR2B mRNA的表達下降，而這種變化于仔鼠出生后28 d消失，提示大鼠于妊娠特定時間吸入七氟烷6 h可能會引起仔鼠出生后短期內(nèi)海馬神經(jīng)元凋亡增加和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常，并且可能會影響到仔鼠短期內(nèi)的認知功能，而這種影響在仔鼠出生后28 d消失。母體妊娠期吸入麻醉藥引起的子代神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的形態(tài)學和行為學改變有待進一步研究。

產(chǎn)科和兒科以鎮(zhèn)靜麻醉為目的的使用NMDAR拮抗劑會引起相應的影響，但其影響是在從嬰兒到成年的各個時期內(nèi)逐漸表現(xiàn)出來［9］。七氟烷臨床劑量的使用能否導致未成熟大腦神經(jīng)元的損傷，這種損傷在患者的生命中何時表現(xiàn)，如何表現(xiàn)都未得到證實，繼續(xù)深入的進行這一研究將會對產(chǎn)科和兒科麻醉有重要的意義。

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