pIRES－PML－RARα重組載體的構建和表達研究

胡剛，岑東芝，楊力建，陳少華，周羽竝，李揚秋，4

(1.廣東省惠東縣人民醫(yī)院內一科，廣東 惠東 516300;2.暨南大學醫(yī)學院血液病研究所;3.暨南大學醫(yī)學院生物化學教研室;4.暨南大學再生醫(yī)學教育部重點實驗室)

利用染色體易位形成的融合基因構建疫苗誘導機體產生特異抗白血病免疫效應，是白血病疫苗研究領域的一個熱點，這種疫苗對清除微小殘留病變，提高療效有重要作用［1－7］。DNA疫苗所包含的目的基因序列以及基因片段的大小，對于DNA疫苗的免疫效果至關重要，如何篩選出合適的抗原片段是DNA疫苗研發(fā)的一個重要內容。為了選擇合適的PML－RARα融合基因片段用于構建DNA疫苗，本研究選擇在PML－RARα基因融合點附近通過逆轉錄多聚酶鏈反應 (reverse transcription polymerase chain reaction，RT－PCR) 擴增出包含融合點的具有不同基因序列長度不同的PMLRARα融合基因片段，并利用這些融合基因片段構建重組真核表達質粒。

1 材料與方法

1.1 材料 pIRES質粒、NB4細胞株由本實驗室保存，DH5α感受態(tài)菌株購自北京天為時代公司，內切酶和連接酶購自大連寶生 (TaKaRa)生物公司，Taq酶購自 Promega公司，LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據GenBank中PMLRARα基因編碼序列特點，按照酶切位點對側翼序列的要求設計包含相應酶切位點的引物，引物由上海博亞生物公司合成。引物構成如下：用于擴增PML－RARα基因 (245 bp) 的引物 (上游引物編號為 PP1，下游引物為 PP2)：PP1：5'－TTA GCTAGC ACCATGCTGGATGGACCGCCTA－3'( 方框內為NheⅠ酶切位點)。PP2：5'－CAA ACGCGT CTACTCACTCAGTAGCCTGAGGACTTG－3'(方框內為MluⅠ酶切位點)，擴增的目的片段長度為245 bp，PCR 產物標記為 PML－RARα(1)。

用于擴增PML－RARα基因 (384 bp)的引物(上游引物編號為PP3，下游引物為PP4)：PP3：5'－CAA GCTAGC AGCATGGTCTCCAATACAACGA－3'(方框內為 NheⅠ酶切位點)。PP4：5'GCG ACGCGT TCAGTCCTGACAGACAAAG－3'(方框內為MluⅠ酶切位點)。擴增的目的片斷長度為384 bp，PCR 產物標記為 PML－RARα［2］。

1.2.2 PCR擴增 從NB4細胞株中提取RNA逆轉錄合成cDNA作為模板 (NB4細胞的RNA提取和cDNA合成均按常規(guī)方法進行)，PP1和PP2作為引物擴增出 PML－RARα(1)，PP3和 PP4作為引物擴增出 PML－RARα(2)?？偡磻w積為 20 μl，其中含2 μl cDNA和1 U聚合酶 (Promega)，其余各試劑的終濃度為：引物 0.5 μmol/L，dNTP 0.1 mmol/L，MgCl21.5 mmol/L，1×Buffer。反應在PCR擴增儀 (BioMetra)中進行。反應條件：首先94℃ 3 min，然后94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃1 min循環(huán)30次，最后72℃ 6 min。擴增產物(標記為PCR1)。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收試劑盒純化后備用。

1.2.3 pIRES－PML－RARα 重組質粒的構建和鑒定將純化后的 PCR 產物 PML－RARα(1)和 PMLRARα(2)用NheⅠ和MluⅠ (TaKaRa)進行雙酶切后分別與經過同樣酶切處理的pIRES質粒利用T4 DNA連接酶 (TaKaRa)連接后，轉化DH5α感受態(tài)菌。用NheⅠ/MluⅠ雙酶切篩選出含有245 bp和382 bp的外源插入片段的陽性克隆pIRESPML－RARα(1)和 pIRES－PML－RARα(2)。

1.2.4 重組質粒DNA序列分析 1 μl質粒DNA用于直接序列分析，應用非放射性、雙脫氧核苷酸末端終止法和 Big－Dye Terminator cycle sequencing ready reaction試劑盒及3100 DNA測序儀(ABI，Perkin Elmer)進行序列分析。

1.2.5 轉染真核細胞后在轉錄水平進行檢測 利用LipofectamineTM2000 Kit轉染K562細胞，收集轉染后培養(yǎng)48 h的K562細胞提取總RNA，逆轉錄合成cDNA作為模板，分別用引物PP1、PP2(用于擴增 PML－RARα(1)，245 bp) 和 PP3、PP4(用于擴增 PML－RARα(2)，384 bp) 進行 PCR擴增，PCR產物于瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。以轉染pIRES－PML－RARα(1)后的 K562 細胞的 RNA 和 cDNA為模板，以PP1、PP2作為引物，進行實時熒光定量PCR檢測。

2 結果

2.1 目的基因的擴增 以NB4細胞的cDNA作為模板，分別用引物PP1、PP2和PP3、PP4進行擴增，擴增出兩種不同長度的PML－RARα基因片段，其大小分別為245 bp和384 bp，PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1、圖2所示，產物大小與預期結果相符。

圖1 PML－RARα(1)基因PCR產物電泳圖

2.2 重組質粒的構建及鑒定 構建的pIRES－PMLRARα(1)重組質粒經過NheⅠ和MluⅠ雙酶切鑒定證明有大小為245 bp的外源插入片段 (圖3)。構建的 pIRES－PML－RARα(2)重組質粒經過 Nhe Ⅰ和MluⅠ雙酶切鑒定證明有大小為384 bp的外源插入片段 (圖4)。

圖2 PML－RARα(2)基因PCR產物電泳圖

2.3 序列分析結果 序列分析結果證實重組質粒中外源插入片段分別與GenBank中各種不同長度的PML－RARα基因序列完全一致，重組質粒pIRES－PML－RARα(1)測序結果見圖 5，重組質粒pIRES－PML－RARα(2)測序結果見圖 6。

2.4 轉錄水平檢測外源質粒在真核細胞中的表達轉染后培養(yǎng)48 h的K562細胞提取總RNA，逆轉錄合成cDNA作為模板，用于擴增PML－RARα基因，PCR結果顯示轉染了各種重組質粒的K562細胞的cDNA中均含有相應的目的基因，提示這些質粒都已經成功地轉染到了K562細胞中，并且能夠在細胞中進行正常轉錄。

以轉染 pIRES－PML－RARα(1)后的 K562 細胞的RNA和cDNA為模板，分別以PP1、PP2作為引物，實時熒光定量PCR檢測結果見圖7。圖中曲線A代表cDNA模板的檢測結果，曲線B代表RNA模板的檢測結果。從該圖中可以看到對于同一種標本，以cDNA為模板的PCR體系熒光信號開始出現指數增長的循環(huán)數比以RNA為模板的PCR體系少，即前者的Ct值比后者要低 (Ct值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數增長階段的閾值所對應的循環(huán)次數)。說明cDNA模板中含有的相應目的基因拷貝數要高于RNA模板，而這是因為cDNA模板中含有被轉染細胞表達的目的基因的cDNA所致。

圖7 實時熒光定量PCR檢測結果

3 討論

利用白血病融合基因構建DNA疫苗，是當前疫苗研究領域的熱點。利用BCR－ABL融合基因構建的DNA疫苗，可以體外誘導特異性抗白血病效應［1，5］。由于許多急性早幼粒細胞白血病 (acute promyelocytic leukemia，APL)患者體內存在 t(15;17) (q22;q21)，形成 PML－RARα 融合基因。有研究發(fā)現含有PML－RARα融合基因的細胞可誘導T細胞克隆性增殖［6］，該現象提示 PMLRARα融合蛋白可以被MHC分子加工提呈，因此可以利用PML－RARα融合基因誘導產生針對APL細胞的特異性免疫應答。Osman等［2］利用 PMLRARα融合蛋白誘導PML－RARα肽特異的CD4+或CD8+CTL。Padua 等［3］應用 PML－RARα 融合基因制備的DNA疫苗在小鼠體內誘導出了特異性免疫保護作用。在構建DNA疫苗時，DNA疫苗所包含的目的基因序列以及基因片段的大小，對于DNA疫苗的免疫效果至關重要，如何篩選出合適的抗原片段是DNA疫苗研發(fā)的一個重要內容。為了比較包含不同長度PML－RARα基因片段的DNA疫苗的免疫效果，本研究嘗試構建了包含245 bp和384bp 的 pIRES－PML－RARα(1)和 pIRES－PMLRARα(2)真核表達質粒，通過序列分析證明了該克隆的正確性，并且該質粒能夠在真核細胞中正常轉錄。本研究的進一步目的在于篩選出用于構建DNA疫苗的合適的PML－RARα基因片段，下一步我們還將在PML－RARα基因融合點附近擴增出不包含融合點的PML－RARα基因片段用于構建重組質粒，并將這些質粒與我們前期已經構建成功的質粒進行小鼠體內試驗，以篩選出具有最佳免疫原性的PML－RARα基因片段，從而為治療APL的DNA疫苗研發(fā)提供重要資料。

［1］Sun JY，Krouse RS，Forman SJ，et al.Immunogenicity of a p210(BCR－ABL)fusion domain candidate DNA vaccine targeted to dendritic cells by a recombinant adeno－associated virus vector in vitro ［J］.Cancer Res，2002，62(11)：3175 －3183.

［2］Osman Y，Takahashi M，Zheng Z，et al.Dendritic cells stimulate the expansion of PML－RAR alpha specific cytotoxic T－lymphocytes：its applicability for antileukemia immunotherapy ［J］.J Exp Clin Cancer Res，1999，18(4)：485－492.

［3］Padua RA，Larghero J，Robin M，et al.PML－RARA－targeted DNA vaccine induces protective immunity in a mouse model of leukemia［J］.Nat Med，2003，9(11)：1413－1417.

［4］胡剛，李楊秋，陳少華，等.pIRES－PML－RARα－h(huán)IL－2 重組質粒的構建和表達研究［J］.癌癥進展，2008，6(4)：357－361.

［5］張玉平，李揚秋，陳少華，等.慢性粒細胞白血病相關的TCR Vβ T細胞的誘導及其限制性和克隆性分析［J］.中國病理生理雜志，2004，20(3)：330－334.

［6］湯冀，李揚秋，楊力建，等.NB4和HL－60細胞誘導的臍血T細胞TCR Vβ基因譜系分析 ［J］.暨南大學學報，2005，26(6)：740－745.

［7］Cen D，Hu G，Zhou Y，et al.Enhancement of specific cellular immune response induced by DNA vaccines encoding PML－RARalpha and hIL－2 genes ［J］.Hematology，2010，15(2)：88 －95.