RIPTO-1在肺腺癌組織中的表達及臨床意義

陳 琛 李曉娟 李晟磊 張國俊

1.鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理教研室 鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科 河南省腫瘤病理重點實驗室，河南鄭州 450001；2.河南中醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，河南鄭州 450008；3.鄭州大學第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南鄭州 450052

RIPTO-1在肺腺癌組織中的表達及臨床意義

陳 琛1李曉娟2李晟磊1張國俊3▲

1.鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理教研室 鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科 河南省腫瘤病理重點實驗室，河南鄭州 450001；2.河南中醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，河南鄭州 450008；3.鄭州大學第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南鄭州 450052

目的 檢測組蛋白去CRIPTO-1在肺腺癌組織中的表達及其臨床意義。 方法 采用免疫組織化學法檢測60例肺腺癌及20例正常肺組織中CRIPTO-1蛋白表達的情況，并分析其表達與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系。 結(jié)果 CRIPTO-1蛋白在肺腺癌組織中的陽性表達率（65.0%）顯著高于正常肺組織（15.0%），組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。其蛋白表達與肺腺癌組織的分化程度、臨床分期、組織學分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 結(jié)論 CRIPTO-1的過表達可能與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，并對判斷肺腺癌患者的生物學行為具有一定的意義。

肺腺癌；CRIPTO-1；免疫組織化學；表達

人的CRIPTO-1基因最初在人畸胎癌cDNA的文庫中鑒定出來，因此也被稱為畸胎癌來源的生長因子-1（teratocarcinoma-derived growth factor 1，TDGF-1），其基因定位于染色體 3p21.3，是表皮生長因子（epidermalgrowthfactor，EGF）-cripto-1－FRL-1-cryptic（CFC）蛋白家族的成員[1]。 CRIPTO-1 mRNA和蛋白已經(jīng)被證實在多種不同類型的腫瘤中高表達，包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌及宮頸癌等[1-4]，提示其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究采用免疫組織化學染色法檢測CRIPTO-1在正常肺組織及肺腺癌組織中的表達情況，并分析其表達與肺腺癌的分化程度、組織學分型、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集鄭州大學第二附屬醫(yī)院2010年1月～2013年3月肺腺癌切除標本60例，其中，男36例，女24例；年齡34～81 歲，平均（55.22±16.2）歲；其中，高-中分化 39 例，低分化21例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期27例；組織學分型：微乳頭型5例，實體型11例，乳頭型26例，腺泡型18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例。另選取20例遠端（10 cm以外）正常肺組織作對照。全部標本均用體積分數(shù)40 g/L多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度4～6 μm，分別用于免疫組織化學及常規(guī)HE染色。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療、免疫治療及其他治療。

1.2 主要試劑

兔抗人CRIPTO-1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司公司，免疫組織化學試劑盒、3，3-二氨基聯(lián)苯胺（digital audio broadcasting，DAB）顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 CRIPTO-1免疫組織化學染色

采用免疫組織化學SP法，常規(guī)脫蠟，PBS清洗，抗原修復，體積分數(shù)3%過氧化氫清除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS清洗，滴加正常山羊血清封閉，加Ⅰ抗（即用型），4℃冰箱過夜，PBS清洗，加Ⅱ抗，PBS清洗，加Ⅲ抗，PBS清洗，DAB顯色。蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用Novus Biologicals公司提供的切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

CRIPTO-1蛋白陽性信號呈淺黃色至棕黃色顆粒，也位于細胞質(zhì)內(nèi)。高倍鏡下隨機選取5個視野（每個視野觀察細胞數(shù)不少于200個），按陽性細胞所占百分比及著色深淺進行結(jié)果判定。采用9分評分制：按照陽性細胞比例≤10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分；按染色強弱：陰性為0分；淡黃色染色為1分；中度黃色染色為2分，棕黃色染色為3分。然后按照“陽性細胞得分×染色強弱得分”計總分，總分＜3為陰性，總分≥3為陽性[5]。

1.5 統(tǒng)計學方法

實驗結(jié)果應用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行分析，采用χ2檢驗進行數(shù)據(jù)分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CRIPTO-1在肺腺癌及正常肺組織中的表達

CRIPTO-1蛋白陽性顯色為棕黃色顆粒，主要定位于細胞質(zhì)，癌細胞中多呈強陽性表達（圖1A），正常肺組織中多不表達或表達程度較弱（圖1B）。CRIPTO-1在肺腺癌及正常肺組織中的表達結(jié)果見表1。

表1 CRIPTO-1在肺腺癌及正常肺組織中的表達（n）

2.2 CRIPTO-1的表達及其與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系

肺腺癌組織中CRIPTO-1蛋白過表達與肺腺癌組織的分化程度、臨床分期、組織學分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.217、5.862、11.334及 8.308，P<0.05）（表 2）。

表2 CRIPTO-1 mRNA的表達及其與臨床病理學特征的關(guān)系（n）

3 討論

CRIPTO-1與它的配體Nodal在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，并被發(fā)現(xiàn)與鼠和人的胚胎干細胞未分化的狀態(tài)密切相關(guān)[6]。與其他胚胎基因一樣，CRIPTO-1在多種類型腫瘤的形成和進展、刺激細胞的增殖、遷移以及腫瘤的血管生成中起重要作用。一些研究表明胚胎發(fā)育期間的細胞命運調(diào)控和腫瘤發(fā)生期間的細胞轉(zhuǎn)化具有共同的信號調(diào)控途徑，提示胚胎信號途徑的未控制的激活可能在成人組織中驅(qū)動細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤的進展[7-9]。此外，CRIPTO-1在許多腫瘤中表達增加，其過表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[10-12]。

CRIPTO-1在小鼠EpH4乳腺上皮細胞中的過表達不僅促使細胞增殖加速和軟瓊脂錨錠非依賴性的生長，而且引起管樣結(jié)構(gòu)的形成，這一變化是在上皮細胞生長在Ⅰ型膠原基質(zhì)的條件下引起的[13]。第一次研究CRIPTO-1在EpH4細胞中的效果表明CRIPTO-1可能在誘導乳腺上皮細胞向間葉細胞過渡中發(fā)揮重要作用。與此類似，過表達CRIPTO-1的人MCF-7乳腺癌細胞除了在無血清的培養(yǎng)基中獲得高增殖能力，而且能增加軟瓊脂中的克隆形成和增加失巢凋亡抗性，同時也表明采用的Boyden小室浸潤分析中浸潤能力的增強[3]，進一步證實CRIPTO-1在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用的是在乳腺不典型增生和MMTVCripto-1轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤中的研究[14]。

本研究利用免疫組織化學方法研究肺腺癌組織中CRIPTO-1蛋白的表達，結(jié)果提示CRIPTO-1蛋白高表達于肺腺癌組織中，而正常肺組織中CRIPTO-1蛋白表達的陽性率非常低，提示從正常肺組織到肺腺癌組織的發(fā)生、發(fā)展及其演進的過程中，CRIPTO-1可能起到了非常重要的作用。筆者進一步分析了CRIPTO-1蛋白的表達與臨床病理學參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRIPTO-1蛋白表達與肺腺癌的分化程度、臨床分期、組織學分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)，提示該基因可能在腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用，但具體的分子機制還有待進一步探討。

[1]Bianco C，Castro NP，Baraty C，et al.Regulation of human Cripto-1 expression by nuclear receptors and DNA promoter methylation in human embryonal and breast cancer cells[J].J Cell Physiol，2013，228（6）：1174-1188.

[2]Kuniyasu H，Yoshida K，Yokozaki H，et al.Expression of cripto，a novel gene of the epidermal growth factor family，in human gastrointestinal carcinomas[J].Jpn J Cancer Res，1991，82（9）：969-973.

[3]D′Antonio A，Losito S，Pignata S，et al.Transforming growth factor alpha，amphiregulin and cripto-1 are frequently expressed in advanced human ovarian carcinomas[J].Int J Oncol，2002，21（5）：941-948.

[4]Das AB，Loying P，Bose B.Human recombinant Cripto-1 increases doubling time and reduces proliferation of HeLa cells independent of pro-proliferation pathways[J].Cancer Lett，2012，318（2）：189-198.

[5]高冬玲，李晟磊，陳奎生，等.金屬蛋白酶抑制基因RECK在食管鱗癌中的表達及生物學意義[J].世界華人消化雜志，2008，16（15）：1634-1638.

[6]Bianco C，Castro NP，Baraty C，et al.Regulation of human Cripto-1 expression by nuclear receptors and DNA promoter methylation in human embryonal and breast cancer cells[J].J Cell Physiol，2013，228（6）：1174-1188.

[7]Watanabe K，Nagaoka T，Lee JM，et al.Enhancement of Notch receptor maturation and signaling sensitivity by Cripto-1[J].J Cell Biol，2009，187（3）：343-353.

[8]Nagaoka T，Karasawa H，Turbyville T，et al.Cripto-1 enhances the canonical Wnt/β-catenin signaling pathway by binding to LRP5 and LRP6 co-receptors[J].Cell Signal，2013，25（1）：178-189.

[9]Nagaoka T，Karasawa H，Castro NP，et al.An evolving web of signaling networks regulated by Cripto-1[J].Growth Factors，2012，30（1）：13-21.

[10]De Luca A，Lamura L，Strizzi L，et al.Expression and functional role of CRIPTO-1 in cutaneous melanoma[J].Br J Cancer，2011，105（7）：1030-1038.

[11]Yoon HJ，Hong JS，Shin WJ，et al.The role of Cripto-1 in the tumorigenesis and progression of oral squamous cell carcinoma[J].Oral Oncol，2011，47（11）：1023-1031.

[12]Lawrence MG，Margaryan NV，Loessner D，et al.Reactivation of embryonic nodal signaling is associated with tumor progression and promotes the growth of prostate cancer cells[J].Prostate，2011，71（11）：1198-1209.

[13]De Angelis E，Grassi M，Gullick WJ，et al.Expression of cripto and amphiregulin in colon mucosa from high risk colon cancer families[J].Int J Oncol，1999，14（3）：437-440.

[14]Urba SG，Orringer MB，Turrisi A，et al.Randomized trial of preoperative chemoradiation versus surgery alone in patients with locoregional esophageal carcinoma[J].J Clin Oncol，2001，19（2）：305-313.

Expression and clinical significance of CRIPTO-1 in lung adenocarcinoma tissues

CHEN Chen1LI Xiao-juan2LI Sheng-lei1ZHANG Guo-jun3▲

1.Department of Pathology,the Medical college of Zhengzhou University;the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University;Henan key Laboratory of Tumor Pathology,Henan Province,Zhengzhou 450052,China;2.Basic Medicine College,Henan University of Traditional Chinese Medicine,Henan Province,Zhengzhou 450008,China;3.Department of Respiratory,the First Affiliated Hospital,Zhengzhou University,Henan Province,Zhengzhou 450052,China

ObjectiveTo investigate expression and clinical significance of CRIPTO-1 in lung adenocarcinoma.MethodsImmunohistochemical staining were used to detect CRIPTO-1 protein expression in 60 cases of lung adenocarcinoma and 20 cases of normal lung tissue and the relationship between CRIPTO-1 expression and clinicopathological features of lung adenocarcinoma was analyzed.ResultsThe positive expression rate of CRIPTO-1 protein in lung adenocarcinoma (65.0%)was significantly higher than that in normal lung tissue (15.0%),and there was a significant difference in group comparison(P＜0.05).The expression of CRIPTO-1 protein was closely correlated with the differentiation,clinical stage,histological type and lymphatic metastasis in lung adenocarcinoma and there was a significant dif ference in group comparison (P＜0.05).ConclusionThe overexpression of CRIPTO-1 may be associated with the carcinogenesis and development of lung adenocarcinoma and can be used for juduing its biological behavior.

Lung adenocarcinoma;CRIPTO-1;Iimmunohistochemistry;Expression

R734.2

A

1674-4721（2013）08（b）-0017-03

河南省教育廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項目（122300410363）▲

張國俊，主任醫(yī)師，教授，研究方向：肺癌的病因及發(fā)病機制

2013-06-07 本文編輯：林利利）