葛根素干預(yù)對(duì)糖尿病腎病大鼠降鈣素基因相關(guān)肽的影響研究

龔志剛 宋春暉 石向群

1.江西師范大學(xué)體育學(xué)院，江西南昌 330022；2.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330022；3.九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西九江 332000

降鈣素基因相關(guān)肽 （calcitonin gene-related peptide，CGRP）是1983年由國外學(xué)者Rosenfeld MG等[1]發(fā)現(xiàn)的一種具有復(fù)雜生物功能的活性多肽，是迄今為止所知的體內(nèi)最強(qiáng)的內(nèi)源性舒血管多肽，CGRP與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。許多研究證實(shí)，糖尿病患者血漿CGRP水平降低，且在合并糖尿病腎病時(shí)降低更明顯[2-4]。本文擬結(jié)合葛根素（puerarin）防治糖尿病的作用機(jī)理，通過對(duì)糖尿病腎病大鼠腹腔注射葛根素注射液，來觀察葛根素對(duì)血漿中CGRP的影響，為DN的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

葛根素注射液 （黑龍江哈爾濱醫(yī)大藥業(yè)有限公司提供，國藥準(zhǔn)字 H20044142，批號(hào)：2010-03-12）；鏈尿佐菌素（STZ，美國Sigma公司），臨用前用檸檬酸緩沖液配成l%的STZ溶液；大鼠降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）試劑盒，內(nèi)皮素（ET）試劑盒，尿微量白蛋白（U-mAIb）試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 儀器

GC-911γ放射免疫計(jì)數(shù)器（中國科技大學(xué)創(chuàng)新股份有限公司）、DNM-9602型酶標(biāo)儀 （北京普朗新技術(shù)有限公司）、HH-8數(shù)字顯示恒溫水浴箱 （常州國華儀器公司）、便攜式血糖儀（日本京都公司）、DT-1001電子天平（江蘇常州衡器廠）、低速大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 動(dòng)物

6周齡Sprague-Dawley雄性大鼠40只，由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，平均體重（220.0±15.6）g，單籠喂養(yǎng)，室溫20℃，相對(duì)濕度 50%，1 d 中光照∶黑暗時(shí)間為 12 h∶12 h，自由攝食飲水。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物建模 40只大鼠預(yù)養(yǎng)一周后，隨機(jī)選取一組10只為正常對(duì)照組，剩余30只空腹12 h，腹腔注射1%STZ-檸檬酸鈉緩沖液35 mg/kg體質(zhì)量。對(duì)照組注射等量檸檬酸鈉緩沖液，依據(jù)72 h后尿糖+++～++++，尾靜脈采血測(cè)血糖，血糖≥16.7 mmol/L者，確定模型建立。除去造模失敗及實(shí)驗(yàn)過程中死亡大鼠，將糖尿病鼠22只納入本實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 分組 （1）正常對(duì)照組（CN組10只）：糖尿病鼠隨機(jī)分為；（2）糖尿病組（D 組 11 只）：（3）葛根素治療組（S 組11只），S組每只給予160 mg/kg/d葛根素注射液進(jìn)行腹腔注射，CN組腹腔注射等容量0.9%氯化鈉溶液，均連續(xù)干預(yù)14周。

1.4.3 標(biāo)本采集 第14周實(shí)驗(yàn)終止時(shí)，各組大鼠在禁食的基礎(chǔ)上，用代謝籠收集24 h尿液，測(cè)定尿白蛋白含量，動(dòng)物經(jīng)乙醚麻醉后心臟取血。測(cè)試生化指標(biāo)：（1）空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）采用便攜式血糖儀測(cè)定；（2）尿微量白蛋白（urinary microalbumin，U-mAIb）采用 ELISA 法測(cè)定；（3）內(nèi)皮素（endothelin，ET）采用放免法測(cè)定；（4）降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）用放免法測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組均數(shù)之間均用單因素方差檢驗(yàn)（one-way ANOVA）進(jìn)行差異性比較，其中P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病大鼠模型的建立

注射STZ后72 h，糖尿病組空腹血糖明顯升高 （P<0.01），空腹血糖均值達(dá)到19.51 mmol/L；葡萄糖耐量試驗(yàn)：兩組大鼠禁食12 h后，按2 g/kg·BW葡萄糖進(jìn)行灌胃，尾部微量取血，分別測(cè)0.5、1.0、2.0 h血糖。實(shí)驗(yàn)組大鼠1 h血糖值達(dá)到高峰，2 h仍高；對(duì)照組0.5 h達(dá)到高峰，2 h恢復(fù)空腹水平，提示實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)糖耐量異常，且實(shí)驗(yàn)組大鼠空腹血糖≥16.7mmol，表明糖尿病大鼠造模成功。見表1。

表1 兩組大鼠血糖和葡萄糖耐量試驗(yàn)結(jié)果（±s，mmol/L）

表1 兩組大鼠血糖和葡萄糖耐量試驗(yàn)結(jié)果（±s，mmol/L）

注：與對(duì)照組比較，＃P<0.05，＃＃P<0.01

組別 空腹血糖 葡萄糖耐量試驗(yàn)0.5 h 1 h 2 h對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組4.67±0.78 19.51±2.51＃＃7.82±1.29 27.31±2.53＃＃5.91±0.56 29.69±2.99＃＃5.06±0.40 24.02±3.57＃＃

2.2 葛根素干預(yù)對(duì)DN大鼠相關(guān)生化指標(biāo)的影響

各組測(cè)得FBG、U-mAIb和ET值，D組和S組都較CN組顯著升高（P<0.05），經(jīng)過14周葛根素干預(yù)后，S組較D組顯著下降（P<0.05）；而血漿CGRP值，D組和S組較CN組顯著下降（P<0.05），且 S組較 D 組明顯升高（P<0.05）。見表2。

3 討論

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病時(shí)腎臟病理改變中只有腎小球硬化癥的全身微血管并發(fā)癥之一，主要病理特征是腎臟高灌注、高濾過、腎小球基底膜增厚和系膜細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)增生，導(dǎo)致彌漫性或結(jié)節(jié)性硬化，出現(xiàn)蛋白尿、高血壓、水腫、腎衰竭等變化，現(xiàn)臨床上已認(rèn)定U-mAIb是DN診斷的標(biāo)準(zhǔn)之一[5]。CGRP是目前已知在體內(nèi)作用最強(qiáng)的擴(kuò)張血管活性多肽，其通過與腎臟血管床上CGRP受體結(jié)合，引起腎臟血管的舒張作用，且可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與修復(fù)[6]。另外CGRP可使腎小球系膜細(xì)胞舒展，從而增加腎小球?yàn)V過面積及濾過率，對(duì)腎臟血管具有強(qiáng)大的保護(hù)作用[7]。CGRP和U-mAIb的聯(lián)合檢測(cè)可能作為DN的監(jiān)控指標(biāo)。

表2 各組大鼠FBG、U-mAIb、ET和CGRP的變化（±s）

表2 各組大鼠FBG、U-mAIb、ET和CGRP的變化（±s）

注：與CN組比較，aP<0.05，與D組比較，bP<0.05

組別 只數(shù) FBG（mmol/L）U-mAIb（μg/min）ET（pg/mL）CGRP（pg/mL）CN組D組S組10 11 11 5.20±0.63 20.54±1.76*16.65±2.3*#14.87±5.65 169.77±40.56*124.32±48.78*#59.59±23.13 112.43±27.66*88.96±24.26*#276.51±76.77 178.99±45.44*226.76±64.88*#

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠U-mAIb升高，血漿CGRP降低，表明模型組已出現(xiàn)DN癥狀。DN體內(nèi)持續(xù)的高血糖導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，使ET分泌增加。ET作為血管活性多肽均可與腎臟相應(yīng)受體結(jié)合，使腎小球毛細(xì)血管壓增加，從而導(dǎo)致尿蛋白漏出增加。而CGRP對(duì)ET具有生物學(xué)拮抗作用，已被學(xué)者證實(shí)[8]。

葛根素作為豆科葛根中提取的異黃酮類化合物，《本草綱目》記載其有生津止渴的功效，目前研究已證實(shí)葛根素對(duì)糖尿病有治療作用[9]。現(xiàn)代藥理研究表明，葛根素能降低血液黏度，抑制血小板凝集，降低血漿ET、血管緊張素Ⅱ及腎素活性，從而擴(kuò)張微動(dòng)脈，改善腎小球的缺血、缺氧及高凝狀態(tài)[10]；同時(shí)還可清除糖基化反應(yīng)所產(chǎn)生的自由基，提高機(jī)體抗氧化能力[11]。本實(shí)驗(yàn)通過14周葛根素干預(yù)后，DM大鼠U-mAIb顯著減少，ET下降明顯，CGRP較模型組明顯增加，從而延緩DN發(fā)生發(fā)展的病理進(jìn)程。崔秀玲等[12]研究發(fā)現(xiàn)：DM模型組大鼠尿清蛋白排泄率顯著升高，且隨病程延長而增加，表明DM可以損傷腎小球，且隨病程的延長損傷加重。分別采用低、中、高劑量葛根素治療后，尿清蛋白排泄率較正常對(duì)照組有一定程度升高，但明顯低于中劑量組，提示葛根素對(duì)DM模型大鼠腎臟有較好的保護(hù)作用。本研究亦表明葛根素對(duì)DN有明顯的改善作用，其部分原因可能是通過提升CGRP的作用，拮抗或抑制ET的釋放，使腎臟血管舒張，改善微循環(huán)，減少U-mAIb的排放。但其具體的機(jī)制還待進(jìn)一步研究。

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