混合乳酸菌復合凍干保護劑的研究

陳賀佳，牟光慶

（大連工業(yè)大學食品學院，遼寧大連 116034）

混合乳酸菌復合凍干保護劑的研究

陳賀佳，牟光慶*

（大連工業(yè)大學食品學院，遼寧大連 116034）

摘 要：將嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌按3∶2∶1比例制備乳酸菌凍干保護劑。通過正交試驗確定混合乳酸菌最佳保護劑配方為：甘氨酸1.0%，脫脂乳10.0%，海藻糖7.0%，山梨醇1.0%。研究表明，凍干乳酸菌發(fā)酵劑發(fā)酵酸度、產(chǎn)香及產(chǎn)黏特性良好，且冷凍干燥法制備的復合凍干保護劑對菌種保護效果優(yōu)于單一保護劑。

關(guān)鍵詞：冷凍干燥；乳酸菌；保護劑

目前真空冷凍干燥技術(shù)已被廣泛應用于各類發(fā)酵劑的制備和商業(yè)化生產(chǎn)中。與傳統(tǒng)的液體發(fā)酵劑、低溫干燥和噴霧干燥方法相比，冷凍干燥后的乳酸菌發(fā)酵劑具有保存期長、菌種不易退化、運輸方便等優(yōu)點[1]。通過真空冷凍干燥原理分析，其干燥過程會造成乳酸菌的損傷[2]。研究表明，添加保護劑可以改變冷凍干燥時菌體細胞所處的物理、化學環(huán)境，減輕或防止冷凍干燥對菌體細胞的損害，使乳酸菌保持原有的理化特性和生物活性，因此保護劑有效利用已成為提高菌種存活率的關(guān)鍵技術(shù)[3]。本研究將嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌按3∶2∶1比例[4]混合，進行乳酸菌凍干保護劑的研究，以選擇最佳混合保護劑配方，達到凍干后菌種存活率最高的目的。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophils，S.t）來自西藏雪蓮，高產(chǎn)胞外多糖，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳酸菌菌庫提供；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，L.a），為大連工業(yè)大學保藏菌種；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，L.b），篩選自輝山酸奶。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種傳代和活化用12%脫脂乳培養(yǎng)基，擴大培養(yǎng)和菌落計數(shù)用MRS培養(yǎng)基[5]。

1.1.3 凍干保護劑

賴氨酸、甘氨酸、谷氨酸、VC、甘露醇、甘油、山梨醇、乳糖、蔗糖、果糖、海藻糖、麥芽糖、可溶性淀粉均為分析純或生化試劑，脫脂乳粉：完達山乳業(yè)有限公司。

以上凍干保護劑分別配制成高濃度溶液。其中氨基酸、糖類和VC溶液經(jīng)0.22 μm孔徑微濾膜過濾除菌，其它凍干保護劑115℃滅菌15 min[6-7]。滅菌后于4℃冰箱備用。

1.1.4 儀器設(shè)備

4K系列真空冷凍干燥機：VirTis公司；Stratos冷凍離心機：Thermo Scientific公司；PHS-3C型精密pH計：上海雷磁儀器廠；NB-1系列數(shù)字式黏度計：上海泥潤智能有限公司；手提式不銹鋼蒸汽消毒器：上海三申醫(yī)療儀器有限公司；722型光柵分光光度計：山東高密彩虹分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 凍干保護劑選擇實驗流程

菌種活化→擴大培養(yǎng)→離心→收集菌體→測活菌數(shù)→加入保護劑→分裝→預凍→真空冷凍干燥→復水→測活菌數(shù)

1.2.2 菌種收集

取脫脂乳活化后的菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，接種量3%，42℃培養(yǎng)24 h。將擴大培養(yǎng)液加入無菌離心管中，4℃，6 000 r/min離心10 min收集菌體，去除上清液[8-10]。

1.2.3 乳酸菌冷凍干燥工藝條件

菌懸液分裝厚度為4 mm，預凍溫度為－80℃，預凍時間為12 h，凍干時間為8 h。

1.2.4 冷凍干燥存活率的確定

凍干前活菌數(shù)檢測：將待測樣品梯度稀釋，采用傾注平板計數(shù)法檢測活菌數(shù)[5]。

凍干后活菌數(shù)檢測：向凍干菌粉中加入0.9%無菌生理鹽水，補足至原體積，活菌數(shù)檢測方法同上。

測凍干前后的活菌數(shù)，按照下列公式計算存活率：

存活率=凍干后用0.9%生理鹽水補足至凍干前體積的活菌數(shù)/凍干前活菌數(shù)×100%1.2.5 酸度的測定

總酸度（T°）：測定24 h內(nèi)總酸度的變化情況，每隔2小時測一次，用0.1 mol/LNaOH標準溶液進行酸堿滴定[11]。

pH：用酸度計測定發(fā)酵24 h內(nèi)pH變化情況，每隔2 h測一次。

1.2.6 粘度的測定

用粘度計測定發(fā)酵24 h內(nèi)黏度的變化情況，每隔4 h測定一次。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌凍干保護劑篩選

根據(jù)相關(guān)研究結(jié)果[12-14]選取15種不同濃度保護劑分別添加至離心菌泥中，制成菌懸液。凍干前其菌懸液的活菌數(shù)為2.16×1010CFU/mL，凍干后計算其存活率，不同種凍干保護劑對乳酸菌存活率影響的平均值存在顯著性差異（P<0.05）。運用Duncan新復極差法進行多重比較，結(jié)果如表1。

表1 乳酸菌凍干保護劑存活率多重比較結(jié)果分析表Table 1 Multiple comparisons of the cryoprotectants survival rate on lactobacillus

由表1所得結(jié)果，可以看出不同凍干保護劑對乳酸菌的保護效果均顯著的高于無菌水的對照組。未添加保護劑的對照組（無菌水）乳酸菌凍干存活率僅為1.6%，添加凍干保護劑的乳酸菌存活率均在20%以上，說明本試驗所選用的15種不同濃度的保護劑對乳酸菌均起到了保護效果，從而提高了凍干存活率。氨基酸、醇類、雙糖、大分子物質(zhì)保護效果最好的分別為：甘氨酸38.1%、山梨醇39.5%、海藻糖48.4%、脫脂乳50.5%。

2.2 乳酸菌凍干保護劑優(yōu)化

研究表明，保護劑主要分為蛋白質(zhì)、多糖、小分子糖、醇和維生素，采用添加保護劑的方法可以減輕冷凍和干燥過程所造成的細胞損傷、死亡及某些酶蛋白分子的鈍化[15-16]。通過對保護劑的篩選試驗以存活率作為衡量指標，選擇存活率較高的甘氨酸、脫脂乳、海藻糖和山梨醇四種保護劑為因素，以凍干存活率為指標，建立L9（34）正交試驗，結(jié)果如表2所示。

比較表1和表2可知，添加單一保護劑的乳酸菌凍干存活率在20.2%～50.4%，而添加正交試驗中9種復合保護劑的乳酸菌凍干存活率在57.2%～89.4%，說明復合保護劑對乳酸菌保護效果比單一保護劑保護效果好。由表2極差分析可知，因素對試驗指標影響的主次順序是B＞A＞C＞D，即脫脂乳對復合乳酸菌的凍干保護效果最好，其次是甘氨酸、海藻糖，山梨醇的保護作用最差。試驗確定最佳組合為A2B2C3D1，即甘氨酸1.0%，脫脂乳10.0%，海藻糖7.0%，山梨醇1.0%，在此條件下，凍干存活率達到89.1%。

表2 凍干保護劑優(yōu)化L9（34）正交設(shè)計與結(jié)果Table 2Plans and results of L9（34）on cryoprotectants

2.3 產(chǎn)酸能力

產(chǎn)酸能力強弱是酸奶生產(chǎn)選用菌種和判斷菌種發(fā)酵活力的重要指標。實驗以總酸度和pH為衡量指標，來檢測凍干后菌株的產(chǎn)酸能力。如圖1所示。

圖1 凍干乳酸菌發(fā)酵過程總酸度和pHFig.1 The fermentation process of total acidity and pH on lactobacillus

由于冷凍干燥對乳桿菌損傷破害的原因，在發(fā)酵前期凍干的乳酸菌產(chǎn)酸能力有所下降，說明凍干燥后乳酸菌的停滯期延長。但總體觀察凍干前后乳酸菌產(chǎn)酸能力來看，凍干后乳酸菌總酸度逐漸增大，同時pH呈下降趨勢，前4 h酸度增加速率較快，在10 h后趨于穩(wěn)定，表明凍干后乳酸菌發(fā)酵活力良好。

2.4 產(chǎn)香特性

發(fā)酵乳的風味主要來自于乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸和各種羰基化合物，其中羰基化合物主要是乙醛和雙乙酰，被認為是構(gòu)成發(fā)酵乳風味的基礎(chǔ)物質(zhì)。從圖2中可以看出，在發(fā)酵過程中，混合乳酸菌之間的共生關(guān)系在促進乳酸菌生長的的同時，也促進雙乙酰和乙醛風味物質(zhì)物質(zhì)產(chǎn)量的提高。發(fā)酵4 h后雙乙酰和乙醛開始積累，8 h后產(chǎn)率降低，產(chǎn)量趨于平穩(wěn)。通過圖8pH變化趨勢可以看出，當發(fā)酵乳pH在5.0～5.5范圍時，才有明顯雙乙酰和乙醛的產(chǎn)生。在pH在3.5～4.0范圍時，雙乙酰和乙醛含量趨于穩(wěn)定。

圖2 乳酸菌發(fā)酵過程雙乙酰和乙醛含量變化趨勢Fig.2 The fermentation process of diacetyl and aldehyde on lactobacillus

2.5 產(chǎn)黏特性

圖3 乳酸菌發(fā)酵過程中黏度和EPS變化趨勢Fig.3 The fermentation process of viscosity and EPS on lactobacillus

發(fā)酵過程中產(chǎn)生微量的黏性物質(zhì)，將有助于改善發(fā)酵乳的組織形態(tài)和黏度，特別是對固形物質(zhì)含量低的發(fā)酵乳尤為重要。發(fā)酵乳黏度增加有兩個原因：一是酪蛋白增加了發(fā)酵乳的黏稠度，二是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌產(chǎn)生的胞外多糖附著在乳酸菌細胞及蛋白質(zhì)基質(zhì)上，增加了發(fā)酵乳的黏稠度。由圖2中可以看出，乳酸菌發(fā)酵過程黏度和胞外多糖含量變化趨勢大致相同，表明胞外多糖含量的增加會促進黏度的增大，相關(guān)研究報道，高產(chǎn)胞外多糖影響發(fā)酵乳的穩(wěn)定性，黏性有關(guān)，可以作為穩(wěn)定劑、增稠劑，改善發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)和口感。有在發(fā)酵后期20 h～24 h黏度和胞外多糖含量下降，說明發(fā)酵時間對黏度和胞外多糖產(chǎn)量具有影響，發(fā)酵時間過長會破壞發(fā)酵乳的黏性和穩(wěn)定性，降低胞外多糖含量。

3 結(jié)論

不同保護劑對菌種起到不同保護作用。本研究所選擇15種保護劑對混合乳酸菌都具有一定的保護效果，其中脫脂乳和海藻糖保護效果最為明顯。由于單一保護劑存在一些缺陷不能高效的保護菌種，如大分子物質(zhì)只能外部保護細胞表面免受損傷，不能滲透到細胞內(nèi)部使細胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度升高，減緩冰晶的生成，從而減少凍干對細胞內(nèi)部的損傷，因此多種保護劑復合使用會比單一保護劑的作用更好些。本研究通過正交試驗的方法，確定對于選定的混合乳酸菌的最佳冷凍干燥保護劑配方為甘氨酸1.0%，脫脂乳10.0%，海藻糖7.0%，山梨醇1.0%，此保護劑使混合乳酸菌的凍干存活率達到89.1%，且凍干后菌種的產(chǎn)酸、產(chǎn)香能力及產(chǎn)黏特性良好。

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Research of the Cryoprotectant for Composited Lactobacillus

CHEN He-jia，MU Guang-qing*
（School of Food Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，Liaoning，China）

Abstract：According to the proportion of lactic acid bacteria cryoprotectants preparation ，the strains matching ratio ofStreptococcus thermophils，Lactobacillus bulgaricus，Lactobacillus acidophilusis 3∶2∶1.By the orthogonal test it determine the optimum cryoprotectant formula for composited lactic acid bacteria as：glycine 1.0%，skim milk 10.0%，trehalose 7.0%，sorbitol 1.0%.According to acidity，producing aroma and viscosity of freeze-dried composited lactic acid bacteria culture is good，composite cryoprotectant protective effect is better single cryoprotectants.

Key words：freeze drying；lactobacillus；cryoprotectant

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.18.033

遼寧省教育廳創(chuàng)新團隊項目（2009T013）

陳賀佳（1984—），女（漢），在讀研究生，研究方向：微生物資源與利用。

牟光慶（1967—），男，教授，研究方向：益生菌及蛋白質(zhì)資源開發(fā)利用。

2012-12-20