柴油脫氮菌的應用研究

唐 克，洪 新

（遼寧工業(yè)大學化學與環(huán)境工程學院，遼寧 錦州 121001）

柴油中含有少量的氮化物，二次加工柴油中氮化物含量更高，氮化物的存在直接或間接影響柴油的顏色和氧化安定性，對柴油的質量影響較大。并且在柴油的催化加工過程中，氮元素易使催化劑中毒［1－2］。另外氮化物在燃燒時產(chǎn)生的大量NOx會對大氣造成嚴重污染［3］。目前，油品中氮化物的脫除方法主要有加氫精制和非加氫精制，采用加氫精制法可對柴油進行深度脫氮，但脫除含氮雜環(huán)化合物（如喹啉等）需在較苛刻的高溫、高壓下操作，不僅所需的費用高，且危險系數(shù)高；非加氫精制方法主要有絡合萃取精制［4］、酸堿精制［5］、溶劑精制［6］等，雖然這些方法各有優(yōu)勢，但也都存在一定的不足，最主要的是操作條件苛刻，產(chǎn)生二次污染。近些年發(fā)展起來的微生物脫氮技術以其投資費用低、設備簡單、操作條件溫和、不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點逐步受到各行各業(yè)的青睞，并在石油微生物脫硫、微生物石油勘探、石油二次開采、脫蠟等方面取得了很大的成績，有些已實現(xiàn)了工業(yè)化［7］。喹啉作為油品中典型的含氮雜環(huán)化合物，其微生物脫除方法已經(jīng)得到了廣泛的研究，Edward［8］，Schwarz［9］，O’Loughlin［10］分別篩選出了降解喹啉較好的菌株。本研究在前期工作［11］中已經(jīng)分離篩選出降解喹啉較好的菌株HY9，但該菌株用于柴油脫氮時脫氮率較低，因此對營養(yǎng)鹽與柴油體積比、表面活性劑Tween80加入量及搖床轉速等各因素對菌株脫除柴油中含氮雜環(huán)化合物的影響進行研究，為微生物在油品脫氮中的應用提供理論依據(jù)。

1 實 驗

1.1 樣品和培養(yǎng)基

菌株來源于實驗室培養(yǎng)的HY9菌株；培養(yǎng)基［12］：KH2PO40.265g，Na2HPO40.426g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001g，MgSO4·7H2O 0.02g，CaCl2·2H2O 0.002g，去離子水100mL，葡萄糖2g，pH值為7.0。

1.2 分析方法

堿氮含量的測定采用SH／T 0162—1992方法；細胞生長量測定采用比濁法；喹啉濃度的測定采用紫外分光光度法。

2 結果與討論

2.1 無機氮對喹啉降解的影響

據(jù)文獻報道［13－14］，喹啉在微生物降解過程中，其中的氮是以氨氮的形式溶于培養(yǎng)基中。因此，為確定溶解在培養(yǎng)基中的銨氮是否影響菌株進一步降解喹啉，實驗中選擇（NH4）2SO4作為無機氮源，研究（NH4）2SO4的加入對喹啉降解的影響。配制100 mL液體培養(yǎng)基6份，其中3份分別添加0.2g（NH4）2SO4、喹啉用量分別為0.07，0.14，0.18mL；另外3份不加無機氮（NH4）2SO4，喹啉用量分別為0.07，0.14，0.18mL。在溫度為35℃、轉速為125 r／min、pH值為7.0的條件下，搖床培養(yǎng)4天，測定OD600（消光系數(shù)）和脫氮率，結果見表1。從表1可以看出，無機氮的加入對于菌株HY9的生長及喹啉降解無明顯影響，但喹啉用量對其影響較大，當喹啉用量為0.07mL時，菌株生長情況及脫氮率均低于喹啉用量為0.14mL時的情況，這是由于菌株生長及其對喹啉的代謝降解過程同步進行，喹啉作為菌株生長的氮源，為微生物生長提供所需氮源，促進菌株的生長，低的喹啉用量不能滿足菌株生長所需的氮源，故生長和降解能力均較低；但當喹啉用量為0.18mL時，其OD600和喹啉脫氮率也低于喹啉用量為0.14mL時的情況，這是因為喹啉有毒，大劑量的喹啉不但會抑制菌株生長甚至可能使微生物死亡，也有可能是由于菌株生長代謝產(chǎn)物的積累抑制了菌株的生長。為了進一步考察喹啉加入量對菌株生長的影響，僅改變液體培養(yǎng)基中喹啉加入量，考察菌株生長情況，結果見圖1。由圖1可見，菌株對喹啉的最大耐受用量為0.14mL，超過0.14mL時，菌株生長受到限制。因此確定16.7mL培養(yǎng)基中喹啉加入量不得超過0.14mL。

表1 無機氮對HY9菌株生長及喹啉降解的影響

圖1 喹啉加入量對菌株生長的影響

2.2 營養(yǎng)鹽與柴油體積比對柴油脫氮的影響

根據(jù)HY9降解喹啉實驗所確定的最佳培養(yǎng)條件，擴大培養(yǎng)HY9菌株，制備菌懸液（菌濃度108個／mL），用于柴油脫氮處理。分別稱取25 mL柴油于4個錐形瓶，按營養(yǎng)鹽與柴油體積比分別為1∶1，1.5∶1，2∶1，2.5∶1加入營養(yǎng)鹽，滅菌后，分別加入3mL菌懸液，在35℃、轉速為125 r／min的條件下，搖床培養(yǎng)4天，靜止分層后，測定柴油脫氮率，結果見表2。從表2可以看出，柴油與營養(yǎng)鹽混合比例對柴油脫氮的效果影響不大。這主要是因為柴油水溶性差，在營養(yǎng)鹽中的溶解度較低，而微生物脫氮對象是油和水構成的混合液，油在水中乳化性差，水中油含量低，微生物發(fā)酵降解所進行的生化反應都是在水相中進行的，所以菌體接觸柴油的幾率較小，脫氮效果差，設法提高柴油在營養(yǎng)鹽中的溶解度是提高菌株的柴油脫氮率的關鍵?？紤]實際操作情況及費用，選取營養(yǎng)鹽與柴油的體積比為1.5∶1。

表2 營養(yǎng)鹽與柴油體積比對柴油脫氮效果的影響

2.3 表面活性劑對柴油脫氮的影響

采用多元醇類非離子型表面活性劑Tween80來增強油水混溶性，非離子型表面活性劑在水溶液中不發(fā)生電離，親水基部分為多聚氧乙烯基，其親水性能由所含的氧乙烯基的數(shù)目來控制，不但穩(wěn)定性較高，而且不易受酸堿和強電解質無機鹽的影響。稱取0.15g Tween80、37.5mL營養(yǎng)鹽和25mL柴油加入到250mL錐形瓶中，滅菌后于35℃、125r／min搖床轉速條件下培養(yǎng)4天，培養(yǎng)后將混合液靜置分層，由于Tween80的增溶作用，需靜置較長時間。分層后取上層油，采用高氯酸滴定法測定堿氮含量，結果見表3。從表3可以看出，加入Tween80后，柴油的脫氮效果明顯增加，脫氮率由12.9%增加到16.7%。

表3 Tween80對柴油脫氮效果的影響

2.4 表面活性劑加入量對柴油脫氮的影響

分別稱取0.100，0.175，0.200，0.250g Tween80，加入到含柴油25mL、營養(yǎng)鹽37.5mL的錐形瓶中，滅菌后，加入菌懸液3mL，在35℃、250r／min轉速條件下?lián)u床培養(yǎng)4天，測定柴油脫氮率，結果見表4。由表4可見，加入0.175g Tween80時，柴油脫氮率最大，為19.3%。另外，實驗現(xiàn)象表明，隨著Tween80加入量的增加，油水分層時間延長。因此，確定25mL柴油中最佳Tween80加入量為0.175g。

表4 表面活性劑加入量對柴油脫氮的影響

2.5 搖床轉速對柴油脫氮的影響

搖床轉速一方面會提高柴油與營養(yǎng)鹽的混合效果，另一方面會增加菌株與柴油的接觸幾率。稱取4份0.175g的Tween80，分別加到含37.5mL營養(yǎng)鹽和25mL柴油的250mL錐形瓶，滅菌后加入菌懸液3mL，在35℃、搖床轉速分別為125，175，250，300r／min的條件下培養(yǎng)4天，測定柴油脫氮率，結果見表5。從表5可以看出，在Tween80存在的條件下，適當提高搖床轉速有利于提高柴油脫氮率，轉速為250r／min時的脫氮率是125r／min時的1.2倍。這是因為提高搖床轉速，可減小油水微粒的粒徑、增加溶液中的溶解氧含量，而溶解氧對于提高好氧微生物的降解作用主要體現(xiàn)在以下兩個方面：①作為氧化還原代謝過程的最終電子受體；②參與甾醇類和脂肪酸的合成。因此溶解氧的增加促進了柴油的脫氮效果。在表面活性劑存在的條件下，增大搖床轉數(shù)，可以減小油水形成的微乳狀液滴尺寸，增加比表面積，進而增加油水接觸界面，提高微生物與柴油中含氮化合物的接觸機會，增強生物催化脫氮作用。當轉速增加到300r／min時，微生物脫氮效率趨于穩(wěn)定。因此確定250r／min為最佳搖床轉速。

表5 搖床轉速對柴油物脫氮效果的影響

2.6 接種量對柴油脫氮的影響

按營養(yǎng)鹽與柴油體積比為1.5∶1配置6組100mL的混合液，分別加入0.175g Tween80，高溫滅菌后，分別加入0.5，1，2，3，4，5，6mL菌懸液（菌濃度108個／mL），在35℃、250r／min的條件下?lián)u床培養(yǎng)4天，測定柴油脫氮率，結果見圖2。由圖2可見，接種量低于3mL時，最初由于接種量過少，生長緩慢，發(fā)酵周期長，脫氮率較低，但隨著接種量的增加，柴油的脫氮率增加，由最初的6.86%增加到接種量為3mL時的19.5%，這是因為隨著接種量的增加，接入的菌株量增加，與柴油中含氮化合物的接觸幾率增加，使脫氮率增加；接種量高于3mL時，柴油的脫氮率并沒有明顯的增長，而接種量過高時會提高成本。因此確定100mL混合液加入3mL菌懸液為最佳接種量。

圖2 接種量對柴油脫氮效果的影響

2.7 脫氮次數(shù)對柴油脫氮的影響

以上實驗結果表明，菌株HY9對柴油的脫氮效果不是很理想，最高脫氮率也僅為19.5%左右，若要提高脫氮率可進行多次降解，因此考察了脫氮次數(shù)對柴油脫氮效果的影響。將一次脫氮后的柴油分層萃取滅菌后，按上述實驗方法和實驗條件加入營養(yǎng)鹽和表面活性劑，在35℃、250r／min的條件下?lián)u床培養(yǎng)4天，將混合液分層萃取，取上層柴油測定脫氮率，如此重復進行3次。結果表明，脫氮次數(shù)分別為1～4次時，對應的脫氮率分別為19.3%，19.8%，21.1%，21.2%。增加柴油脫氮次數(shù)，脫氮率僅有小幅提高，脫氮效果并不是很明顯，這有可能是該菌株只對部分含氮雜環(huán)化合物有降解作用，而對另外一些含氮雜環(huán)化合物的降解能力極弱或不能降解，所以通過多次降解來提高柴油脫氮效果的方式不可取。若要進一步提高菌株的脫氮效果，應加強菌株的分子生物學及酶學研究，進行基因重組，構建優(yōu)良菌株，提高脫氮效果。影響微生物脫氮的另一個關鍵問題是菌株對喹啉等有機氮化物的吸收能力，它與菌株和有機相的接觸情況及有機氮化物在液相中可溶性有關，因為與微生物脫氮效果密切相關的三個因素為微生物對有機氮化物的依附情況、輔助吸收機制及物質的擴散。加強傳質過程研究，采取一定有效措施，進一步增加菌株的疏水性，提高其親油性，將會有效提高柴油的脫氮效率。

3 結 論

（1）采用HY9菌株降解喹啉時，無機氮源（NH4）2SO4的加入對喹啉的降解基本無影響，16.7 mL培養(yǎng)基中菌株對喹啉的耐受用量為0.14mL。

（2）非離子表面活性劑Tween80的加入，增強了油水混溶性，柴油脫氮率從12.9%增加到16.7%，脫氮率明顯提高，具有較好的增溶性；25mL柴油中Tween80的最佳添加量為0.175g；搖床轉速影響菌株對柴油中含氮化合物的降解能力，最佳搖床轉速為250r／min；100mL混合液加入3mL菌懸液為最佳接種量；最佳營養(yǎng)鹽與柴油體積比為1.5∶1；增加脫氮次數(shù)對柴油的脫氮效果影響較小。

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