采后BTH處理及粉紅單端孢(Trichothecium roseum)挑戰(zhàn)接種對(duì)厚皮甜瓜果實(shí)苯丙烷代謝活性的誘導(dǎo)

鄧惠文，畢 陽(yáng)，葛永紅，任亞琳，劉瑤瑤

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

厚皮甜瓜(Cucumis melo L.)是我國(guó)西北地區(qū)的主要經(jīng)濟(jì)作物，外形美觀、風(fēng)味獨(dú)特，深受廣大消費(fèi)者喜愛。然而，由于產(chǎn)期集中，且正值高溫季節(jié)，加之缺乏有效的采后處理和必要的冷鏈，爛損頗為嚴(yán)重［1］。甜瓜在采后貯運(yùn)過(guò)程中易受 Trichothecium roseum侵染而發(fā)生粉霉病，給生產(chǎn)者和經(jīng)營(yíng)者造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。該病原物可在采后貯運(yùn)期間通過(guò)傷口進(jìn)入產(chǎn)品體內(nèi)，進(jìn)而引起腐爛［2］?；瘜W(xué)殺菌劑雖然可以有效控制甜瓜粉霉?。?］，但存在殺菌劑殘留、環(huán)境污染和病原物產(chǎn)生抗藥性等問(wèn)題［4］。近年來(lái)利用物理、化學(xué)和生物的方法誘導(dǎo)植物抗病性逐漸成為果蔬采后病害控制的研究熱點(diǎn)［5］。苯丙噻重氮(Acibenzolar-S-methyl，ASM or BTH)是第一個(gè)人工合成的誘抗劑，屬水楊酸類似物。其本身對(duì)病原菌生長(zhǎng)沒(méi)有直接的抑制，而是通過(guò)激發(fā)植物體內(nèi)的系統(tǒng)抗性來(lái)增強(qiáng)對(duì)病原菌侵染的抵抗而減輕采后腐爛［6］。有報(bào)道表明，BTH處理可有效提高多種果實(shí)的采后抗病性，果實(shí)的抗病性的提高與苯丙烷代謝活性的增強(qiáng)相關(guān)，例如，采前BTH(ASM)多次噴灑處理及采后 BTH 處理可分別誘導(dǎo)甜瓜［7］、鴨梨［8］、桃子［9］以及香蕉［10］果實(shí)苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性提高，BTH還能誘導(dǎo)甜瓜中4-香豆素-輔酶A連接酶(4CL)活性的增強(qiáng)［11］。此外，BTH處理能促進(jìn)草莓和芒果中的總酚、類黃酮及木質(zhì)素的積累［12-13］。但上述報(bào)道均未研究病原物損傷接種BTH處理果實(shí)苯丙烷代謝關(guān)鍵酶和產(chǎn)物積累的變化。本文擬研究采后BTH處理及Trichothecium roseum挑戰(zhàn)接種對(duì)PAL和4CL活性，以及總酚、類黃酮及木質(zhì)素積累的影響，以期為BTH對(duì)果實(shí)的采后誘抗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試‘玉金香’甜瓜 2010年7月采自于甘肅省民勤縣收成鄉(xiāng)露天栽培大田(果實(shí)可溶性固形物含量9.29%，硬度7.9kg/cm2)，單果套發(fā)泡網(wǎng)袋后入包裝箱(20個(gè)/箱)，第2d運(yùn)抵甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，于常溫(22±2)℃、相對(duì)濕度55%～60%下貯藏待用。果實(shí)經(jīng)BTH處理后24h挑戰(zhàn)接種T.roseum;BTH(a.i50%)澳大利亞悉尼大學(xué)提供;粉紅單端孢(Trichothecium roseum)分離自典型自然發(fā)病果實(shí)，PDA上保存待用。

GY-B型果實(shí)硬度計(jì) 杭州托普儀器有限公司;WYA型手持糖量計(jì) 上海立光精密儀器有限公司;UV-2450型 島津分析儀器;H-1850R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸浮液的配制 參照參考文獻(xiàn)［14］的方法。取25℃下培養(yǎng)10d的帶菌PDA平皿一個(gè)，加入含0.05%Tween20的無(wú)菌水約10mL，用玻璃棒刮下平板上的病原菌孢子，然后轉(zhuǎn)入50mL三角瓶中，在WYX-A微型旋渦混合器上振蕩15s，再用雙層紗布過(guò)濾，濾液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)算出孢子懸浮液的濃度后，最后稀釋至所需濃度(1×105孢子/mL)。

1.2.2 BTH浸泡處理果實(shí) 參照曹建康的方法［15］并修改。將表面用自來(lái)水沖洗干凈并晾干的果實(shí)浸入0.1g/L BTH溶液中10min(內(nèi)含0.05%的Tween 20)，取出晾干后入包裝箱，于常溫條件下(22±2)℃;RH 55%～60%貯藏待用，以清水(內(nèi)含0.05%的Tween 20)處理作為對(duì)照。

1.2.3 損傷接種果實(shí) 參照畢陽(yáng)和張維一方法［16］選取BTH處理后常溫貯藏48h的果實(shí)，經(jīng)75%酒精表面消毒后，用滅菌打孔器在果實(shí)表面等距離刺孔6個(gè)(深3mm，直徑3mm)。分別取10μL孢子懸浮液接入孔內(nèi)。稍作晾干后入包裝箱，室溫(22±2)℃;RH 85%～90%條件下貯藏，并定期測(cè)定病斑直徑。

1.2.4 取樣 參照Bi Y等的方法［17］。BTH處理后第 0、2、4、6、8、10d 取皮下 1～3mm 處果肉組織 3g。挑戰(zhàn)接種樣品則取接種 T.roseum 后第2、4、6、8、10d取外皮下1～3mm處果肉組織3g。組織用錫箔紙包好，液氮冷凍，在-80℃超低溫冰箱中保存待測(cè)。

1.2.5 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測(cè)定 參照Koukol等的方法［18］并修改。稱取3g果肉組織，加入3mL經(jīng)4℃預(yù)冷的、0.2mol/L、pH8.8的硼酸緩沖液(含10%PVPP，1mmol/L EDTA 和 50mmol/L β-琉基乙醇)，在冰浴條件下研磨成勻漿，于4℃、15000×g離心20min，上清液立即用于酶活測(cè)定。PAL酶促反應(yīng)體系包括:2mL，pH8.8的硼酸緩沖液(0.2mol/L)，300μL粗酶液和1mL 0.02mol/L的 L-苯丙氨酸。24℃下反應(yīng)2min時(shí)，在UV-2450型紫外可見分光光度儀上測(cè)其OD290?？瞻滓耘鹚峋彌_液代替酶液。酶活以每分鐘內(nèi)OD290變化0.01為1個(gè)活性單位(U)，酶活性以U/mg protein表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 香豆酰-輔酶A連接酶(4CL)活性的測(cè)定參照朱明華等的方法［19］并修改。取3g冷凍果肉，加入3mL，0.2mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0，含25%甘油、0.1NDTT)，勻漿，四層紗布過(guò)濾，10000×g離心20min，上清液即為粗酶液，4CL反應(yīng)體系包括0.45mL 15μmol/L Mg2+;0.15mL 15μmol/L p-香豆酸;0.15mL ATP(50μmol/mL)、0.15mL CoA(1μmol/mL)以及0.5mL酶液(對(duì)照不加香豆酸)。在40℃下反應(yīng)10min，于333nm處測(cè)定吸光值。以每分鐘吸光值變化0.01為1個(gè)活性單位(U)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 木質(zhì)素含量的測(cè)定 參照Morrison等的方法［20］。取3g果肉組織與預(yù)冷的3mL 95%乙醇研磨，4℃下12000×g離心10min，沉淀物用95%乙醇沖洗3次，再用乙醇∶正己烷=1∶2(V/V)沖洗3次，收集沉淀使其干燥，干燥物溶于1mL 25%溴化乙烷冰醋酸溶液中，70℃恒溫水浴30min，然后加1mL 2mol/L NaOH終止反應(yīng)。再加2mL冰醋酸和0.1mL 7.5mol/L羥銨鹽酸，離心，取上清液0.5mL，用冰醋酸定容至9mL，280nm下測(cè)定樣品吸光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。木質(zhì)素含量以O(shè)D280/g FW表示。

1.2.8 總酚和類黃酮含量的測(cè)定 參照Pirie和Mullins方法［21］并修改。稱取3g果肉組織于預(yù)冷的5mL 1%HCl-甲醇溶液中，在冰浴條件下充分研磨提取，然后于4℃下12000×g離心10min，上清液直接于280、325nm下比色。總酚含量以O(shè)D280/g FW表示。類黃酮含量單位表示為 OD325/g FW。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 蛋白含量的測(cè)定 參照Bradford的方法［22］，以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 Microsoft Excel 2007和DPS 7.55數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(±SE)或進(jìn)行Duncan’s多重差異顯著分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 BTH處理對(duì)果實(shí)損傷接種T.roseum病斑直徑的影響

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，處理和損傷接種果實(shí)的病斑直徑均逐漸擴(kuò)大，但處理果實(shí)病斑直徑顯著低于對(duì)照，處理后第6d和7d病斑直徑分別比對(duì)照低17.11%和31.85%(圖1)。

2.2 BTH處理對(duì)果實(shí)PAL和4CL活性的影響

貯藏期間對(duì)照及處理果實(shí)PAL活性整體呈先升高后降低的趨勢(shì)，且均在第8d出現(xiàn)峰值(圖2A)。BTH處理誘導(dǎo)了PAL活性的提高。損傷接種進(jìn)一步提高了PAL活性高峰的提前出現(xiàn)，第6d達(dá)到高峰值;在第6d，BTH+挑戰(zhàn)較CK+挑戰(zhàn)高但效果不明顯;隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照和處理果實(shí)的4CL活性總體呈現(xiàn)升高后降低再升的趨勢(shì)，且處理果實(shí)4CL活性在貯藏期間均高于對(duì)照(圖2B)。損傷接種明顯促進(jìn)了果實(shí)4CL活性的升高，在第6d，BTH+挑戰(zhàn)較CK+挑戰(zhàn)高出18.59%;BTH較對(duì)照高出12.04%。

圖1 BTH處理對(duì)T.roseum損傷接種果實(shí)病斑直徑的影響Fig.1 Effect of BTH treatment on the lesion diameter of fruits inoculated with T.roseum

圖2 BTH處理及挑戰(zhàn)接種對(duì)厚皮甜瓜PAL(A)、4CL(B)酶活性的影響Fig.2 Effect of BTH treatment on activity of PAL(A)and 4CL(B)in muskmelon fruits

2.3 BTH處理對(duì)果實(shí)木質(zhì)素、總酚和類黃酮含量的影響

貯藏期間對(duì)照及處理果實(shí)的木質(zhì)素含量整體呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，在第8d達(dá)到最大，且處理果實(shí)的木質(zhì)素含量高于對(duì)照果實(shí)(圖3A)。挑戰(zhàn)接種進(jìn)一步提高了果實(shí)木質(zhì)素含量的提高，在第8d，BTH+挑戰(zhàn)較CK+挑戰(zhàn)差異不大;對(duì)照和BTH處理果實(shí)總酚和類黃酮含量總體呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)并在第6d達(dá)到高峰值。在整個(gè)貯藏過(guò)程中BTH處理果實(shí)中的總酚和類黃酮含量都高于對(duì)照果實(shí)。挑戰(zhàn)接種促進(jìn)了果實(shí)中總酚和類黃酮的積累。第8d，BTH+挑戰(zhàn)總酚含量較CK+挑戰(zhàn)總酚含量高出16.13%;BTH較對(duì)照差異不大(圖3B);第6d，BTH+挑戰(zhàn)類黃酮含量較CK+挑戰(zhàn)類黃酮含量高，但不存在顯著差異(圖3C)。

圖3 BTH處理及挑戰(zhàn)接種對(duì)厚皮甜瓜果實(shí)木質(zhì)素(A)、總酚(B)和類黃酮含量(C)的影響Fig.3 Effect of BTH treatment on content of lignin，total phenolic and flavonoids in muskmelon fruits

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，0.1g/L BTH處理可以有效抑制處理后損傷接種T.roseum果實(shí)的病斑直徑，從而增強(qiáng)采后果實(shí)的抗病性。該結(jié)果與BTH處理有效控制香蕉炭疽?。?0］、甜櫻桃炭疽?。?3］、沙糖桔綠霉?。?4］、以及枇杷炭疽?。?5］的結(jié)果類似。BTH 對(duì)甜瓜粉霉病的抑制與其激活防御酶和積累抗菌物質(zhì)密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，多種防御酶和抗菌物質(zhì)在果蔬的抗病反應(yīng)中具有積極的作用［26］。本研究中，4CL活性顯著增加及總酚類黃酮的積累也證明了這一點(diǎn)，并且挑戰(zhàn)接種進(jìn)一步促進(jìn)其抗性的增加。PAL是苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，參與了多種激發(fā)子誘導(dǎo)的抗性［27］，增強(qiáng)了植物對(duì)病原物侵染的抵抗能力［28］。本研究結(jié)果顯示，BTH處理甜瓜果實(shí)誘導(dǎo)抗病性與PAL酶活性增加有一定相關(guān)性，這與前人在鴨梨［8］、桃子［9］以及香蕉［10］上的研究類似;挑戰(zhàn)接種使得PAL酶活峰值提前，可能是由于挑戰(zhàn)接種激活了活性氧代謝，其中產(chǎn)生的H2O2可能作為一種信號(hào)分子誘導(dǎo)了PAL的基因表達(dá)。此外，BTH或病原物侵染也可作為誘導(dǎo)抗病性的信號(hào)［29］。4CL是控制苯丙烷主途徑向分支途徑轉(zhuǎn)折的關(guān)鍵酶，在植物與外界環(huán)境互作過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其代謝產(chǎn)物總酚、類黃酮以及木質(zhì)素的積累可以抵抗病原物的侵染、增強(qiáng)果實(shí)的表皮結(jié)構(gòu)，從而提高其抗病性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BTH處理及挑戰(zhàn)接種后果實(shí)4CL活性及總酚、類黃酮含量迅速增加，證明了4CL以及總酚和類黃酮參與了甜瓜果實(shí)的抗病過(guò)程?？傊?，采后BTH及T.roseum挑戰(zhàn)接種能夠明顯增強(qiáng)甜瓜果實(shí)的苯丙烷代謝，但BTH及挑戰(zhàn)接種如何在生化和分子水平系統(tǒng)誘導(dǎo)苯丙烷代謝活性的增強(qiáng)尚需進(jìn)一步研究。

［1］Bi Y，Ge Y H，Wang C L，et al.Melon production in China［J］.Acta Horticulturae，2007，731(1):493-500.

［2］張維一，畢陽(yáng).果蔬采后病害與控制［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996:156-158.

［3］馬凌云，畢陽(yáng)，張正科，等.采前嘧菌酯處理對(duì)‘銀帝’甜瓜采前及采后主要病害的控制［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，39:14-17.

［4］Terry L A，Joyce D C.Elicitors of induced resistance in postharvest horticultural crops:a brief review［J］.Postharvest Biology and Technology，2004，32:1-13.

［5］Bi Y，Li Y C，Ge Y H，et al.Induced resistance in melons by elicitors for the control of postharvest diseases［J］.Plant Pathology in the 21st Century，2010，2:31-41.

［6］Edreva A.A novel strategy for plant protection:Induced resistance［J］.Journal of Cell and Molecular Biology，2004(3):61-69.

［7］Zhang Z K，Bi Y，Ge Y H，et al.Multiple pre-harvest treatments with acibenzolar-S-methyl reduce latent infection and induce resistance in muskmelon fruit［J］.Scientia Horticulturae，2011，130:126-132.

［8］Cao J，Jiang W，He H.Induced resistance in Yali pear(Pyrus bretschneideriRehd.)fruitagainstinfection by Penicillium expansum by postharvest infiltration of acibenzolar-S-methyl［J］.Phytopathology，2005，153:643-644.

［9］Liu H X，Jiang W B，Bi，Y.Postharvest BTH treatment induces resistance of peach(Prunus persica L.cv.Jiubao)to infection by Penicillium expansum and enhances activity of fruit defense mechanisms［J］.Postharvest Biology and Technology，2005，35:263-269.

［10］麻寶成，朱世江.苯并噻重氮和茉莉酸甲酯對(duì)采后香蕉果實(shí)抗病性及相關(guān)酶活性的影響［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39:1220-1227.

［11］Vogt T.Phenylpropanoid biosynthesis［J］.Molecular Plant，2010，3:2-20.

［12］Cao S F，Hu Z C，Zheng Y H，et al.Effect of BTH on antioxidant enzymes，radical-scavenging activity and decay in strawberry fruit［J］.Food Chemistry，2011，125:145-149.

［13］Zhu X，Cao J，Wang Q，et al.Postharvest infiltration of ASM reduces infection of mango fruits(Mangifera indica L.cv.Tainong)by colletotrichum gloeosporioides and enhances resistance inducing compounds［J］.Journal of Phytopathology，2008，156:68-74.

［14］周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程［M］.第二版.北京:高等教育出版社，2006.

［15］曹建康.SA、ASM、INA和檸檬酸對(duì)鴨梨果實(shí)采后抗病性和品質(zhì)的影響［D］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

［16］畢陽(yáng)，張維一.感病甜瓜果實(shí)呼吸、乙烯及過(guò)氧化物酶變化的研究［J］.植物病理學(xué)報(bào)，1993，23:69-73.

［17］Bi Y，Tian S P，Zhao J，et al.Harpin induces local and systemic resistance against Trichotherium roseum in harvested hami melons［J］.Postharvest Biology and Technology，2005，38:183-187.

［18］Koukol J，Conn E E.The metabolism of aromatic and properties of the phenylalanine deaminase of Hordeum vulgare［J］.Biology Chemical，1961，10:2692-698.

［19］朱明華，歐陽(yáng)觀察，薛應(yīng)龍.黃瓜免疫誘導(dǎo)過(guò)程中G6PD、PAL、4CL、PO活性和木質(zhì)素含量的變化［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1990，6:21-26.

［20］Morrison I M.A semi-micro method from the determination of lignin and its use in predicting the digestibility of forage crops［J］.Sci Food Agric，1972，23:455-463.

［21］Pirie A，Mullins M G.Changes in anthocyanin and phenolic content of grapevine leaf and fruit tissue treated with sucrose，nitrate and abscisic acid［J］.Plant Physiol，1976，58:468-472.

［22］Bradford M N.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein using the principle of protein2dye binding［J］.Annal Biochem，1976，72:248-254

［23］劉敏，彭建清，李建中，等.BTH對(duì)南山甜櫻桃采后生理和炭疽病的影響［J］.中國(guó)南方果樹，2010，39:23-25.

［24］徐蘭英，汪躍華，龐學(xué)群，等.BTH和BABA處理對(duì)采后沙糖桔病害和品質(zhì)的影響［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(8):256-258.

［25］張紫微，朱世江.苯并噻重氮對(duì)采后枇杷果實(shí)病害及品質(zhì)的影響［J］.食品科學(xué)，2009，30:264-267.

［26］Cao J K，Jiang W B.Induction of resistance in Yali pear(Pyrus bertschneideri Reld.)fruit against postharvest diseases by acibenzolar-S-methyl sprays on trees during fruit growth［J］.Scientia Horticulturae，2005，110:181-186.

［27］Mauch-Mani B，Slusarenko A J.Production of salicylic acid precursors is a major function of phenylalanine ammonia-lyase in the resistance of Arabidopsis to Peronospora parasitica［J］.The Plant Cell，1996，8:203-212.

［28］Whetten R，Sederoff R.Lignin biosynthesis［J］.The Plant Cell，1995，7:1001-1013.

［29］Lin T C.Accumulation of H2O2in xylem fluids of cucumber stems during ASM-induced systemic acquired resistance(SAR)involves increased LOX activity and transient accumulation of Shikimic acid［J］.Plant Pathol，2009，125:119-130.