基于活體成像的裸小鼠肺癌移植瘤模型建立及意義

姜昱竹，謝書陽，胡雪梅，王躍嗣

(濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)校區(qū)，山東煙臺(tái) 264003)

荷瘤動(dòng)物模型是研究腫瘤體內(nèi)生長、轉(zhuǎn)移機(jī)制以及研發(fā)抗腫瘤藥物的重要工具。傳統(tǒng)的動(dòng)物模型建立方法主要是將腫瘤細(xì)胞接種于免疫缺陷的小鼠皮下，待腫瘤生長到一定程度后定期測量腫瘤體積。但該方法很難直觀、活體、動(dòng)態(tài)觀察腫瘤的生長轉(zhuǎn)移情況，且人為測定腫瘤體積一定程度上可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度，因此建立便于檢測的荷瘤動(dòng)物模型具有非常重要的意義［1］?；铙w成像技術(shù)是近幾年新興的一項(xiàng)采用活體生物發(fā)光或熒光成像技術(shù)直接監(jiān)測活細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的生物學(xué)行為的技術(shù)，目前已用于生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)及藥物研發(fā)等領(lǐng)域并取得了大量研究成果［2～6］。2011年6月，我們采用pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H358，G418篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的NCI-H358-GFP細(xì)胞;應(yīng)用活體成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察裸鼠皮下移植瘤的生長情況，并定量檢測熒光表達(dá)水平，旨在為肺癌的深入研究和藥物開發(fā)提供理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1 材料 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H358系本實(shí)驗(yàn)室凍存，體外常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中。pEGFP-N1為本實(shí)驗(yàn)室保存，脂質(zhì)體Lipofectamine LTX、G418分別為Invitrogen公司與Sigma公司產(chǎn)品。活體成像系統(tǒng)購自美國CRi公司，熒光顯微鏡購自O(shè)lympus公司。4～6周雄性BALB/c/nu裸鼠購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作均在本實(shí)驗(yàn)室無特定病原體(SPF)的飼養(yǎng)間進(jìn)行。本研究采用SPSS13.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的NCI-H358-GFP細(xì)胞的建立和鑒定 取對(duì)數(shù)生長期的NCI-H358細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～90%即按照Lipofectamine LTX試劑操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后，細(xì)胞1∶12傳代至直徑100 mm培養(yǎng)皿，同時(shí)以相同的密度傳代未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照。細(xì)胞貼壁后，加入終濃度為1000 μg/mL的G418。根據(jù)細(xì)胞生長情況，每1～3 d更換培養(yǎng)液。待對(duì)照組細(xì)胞全部死亡后，即得到初步抗性克隆。將初步抗性克隆制備成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，增殖后轉(zhuǎn)入24孔板擴(kuò)大培養(yǎng)。重復(fù)此單克隆化過程3次，即得到穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的NCIH358-GFP細(xì)胞。通過熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀對(duì)獲得的各單克隆進(jìn)行熒光強(qiáng)度及穩(wěn)定性檢測，挑選最佳克隆行生長特性相關(guān)指標(biāo)觀察。①穩(wěn)定性:將獲得的NCI-H358-GFP細(xì)胞傳代，收集第5代、第10代細(xì)胞，熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測綠色熒光蛋白表達(dá)水平。②生長特性:分別取對(duì)數(shù)生長期的NCI-H358細(xì)胞、NCI-H358-GFP細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后接種于96孔板，接種密度為1×104/mL，各設(shè)3 個(gè)重復(fù)孔。于接種 24、48、72、96 h 分別取細(xì)胞進(jìn)行MTT試驗(yàn)，測光密度(OD)值，以此繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3 裸鼠皮下移植瘤模型的建立及生長情況觀察取對(duì)數(shù)生長期的NCI-H358-GFP細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/mL。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色測定細(xì)胞活性后，取200 μL細(xì)胞懸液接種于4～6周雄性BALB/c/nu裸鼠腋窩皮下。接種后8、15、22、29、36 d 采用活體成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察皮下移植瘤生長情況，并定量檢測各時(shí)間點(diǎn)熒光表達(dá)水平。以細(xì)胞接種時(shí)間為橫坐標(biāo)、移植瘤發(fā)射的熒光光子數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，得到穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的NCI-H358-GFP細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 NCI-H358-GFP細(xì)胞的建立 轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒24 h后，在熒光顯微鏡下可以觀察到 NCIH358細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有綠色熒光蛋白表達(dá)，但細(xì)胞間熒光強(qiáng)度差異明顯。收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，進(jìn)行G418加壓篩選，最終獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的NCIH358-GFP細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察可見細(xì)胞表達(dá)較高水平的綠色熒光蛋白，熒光較為均勻地分布于整個(gè)細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染率接近100%(圖1A);用流式細(xì)胞儀對(duì)獲得的NCI-H358-GFP細(xì)胞進(jìn)行檢測，其綠色熒光蛋白表達(dá)率達(dá)96%(圖1B)。MTT法檢測NCIH358細(xì)胞和NCI-H358-GFP細(xì)胞的生長情況(圖2)，自細(xì)胞生長曲線可以看出，篩選出來的 NCIH358-GFP細(xì)胞和NCI-H358細(xì)胞生長速度無顯著性差異，P＞0.05。表明穩(wěn)定細(xì)胞構(gòu)建過程對(duì)NCIH358-GFP細(xì)胞的生長特性無明顯影響。

圖1 NCI-H358-GFP細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)情況

2.2 皮下移植瘤的生長情況 接種第8天時(shí)在接種部位即觀察到熒光信號(hào);隨著接種時(shí)間延長，移植瘤體積逐漸增大，熒光光子數(shù)逐漸增加。NCI-H358-GFP細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長曲線見圖3。

3 討論

圖2 NCI-H358細(xì)胞和NCI-H358-GFP細(xì)胞的生長曲線

圖3 皮下移植瘤的生長曲線

目前活體成像技術(shù)已在生物、醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注，與之密切相關(guān)的活細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)亦快速發(fā)展［2，5～8］。自 Chalfie 等［9］首次在大腸埃希菌和線蟲中成功表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)之后，GFP逐漸成為應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記性蛋白之一［8～12］。與 β-半乳糖苷酶(LacZ)、螢火蟲熒光素酶(Luc)等相比，GFP的熒光信號(hào)強(qiáng)度高，不需要任何底物或其他輔助因子，易于檢測;其分子量小(25～30 kD)，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無毒性，不影響細(xì)胞的正常生長和功能［10，12］。因此本研究采用 pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H358，G418篩選后獲得的NCI-H358-GFP細(xì)胞經(jīng)熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀鑒定，該細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白，表達(dá)率達(dá)96%。對(duì)NCI-H358細(xì)胞和NCI-H358-GFP細(xì)胞的生長情況進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，GFP的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并沒有改變細(xì)胞原有的生物學(xué)性狀。

為探討惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋求特異性的治療藥物，人類腫瘤動(dòng)物模型的建立在基礎(chǔ)研究及臨床研究中均有極其重要的意義［1］。但傳統(tǒng)的腫瘤動(dòng)物模型只能在不同時(shí)間點(diǎn)侵入性地觀察或處死動(dòng)物以獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，不能連續(xù)、動(dòng)態(tài)地觀察動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移情況，無法反映細(xì)胞或基因的時(shí)間性及空間性表達(dá)?；铙w成像技術(shù)能夠進(jìn)行早期、無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的動(dòng)物活體觀察，可對(duì)同一個(gè)研究個(gè)體進(jìn)行長時(shí)間反復(fù)跟蹤觀察，避免不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之間的個(gè)體差異，并大大減少動(dòng)物用量;該技術(shù)還可通過熒光定量分析軟件測定腫瘤總的熒光強(qiáng)度，監(jiān)測腫瘤的生長情況［1，12，13］。本研究結(jié)果顯示，將穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的NCI-H358-GFP細(xì)胞接種于BALB/c/nu裸小鼠皮下第8天就可觀察到熒光信號(hào)，而此時(shí)按傳統(tǒng)方法尚較難測量移植瘤體積;伴隨著時(shí)間的推移，移植瘤的體積逐漸增大，熒光強(qiáng)度亦顯著增強(qiáng)。表明活體成像系統(tǒng)可通過平均光子數(shù)客觀反映腫瘤的生長情況，減少人為測量帶來的實(shí)驗(yàn)誤差，獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)束未檢測到腫瘤轉(zhuǎn)移情況，可能與選用的細(xì)胞系有關(guān)。

綜上所述，本研究在成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)GFP的人非小細(xì)胞肺癌NCI-H358-GFP細(xì)胞的基礎(chǔ)上，利用該細(xì)胞建立了裸小鼠肺癌皮下移植瘤模型，并通過活體成像系統(tǒng)連續(xù)、動(dòng)態(tài)、定量監(jiān)測了NCI-H358-GFP細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的生長情況。本研究為開展肺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究及抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了直觀、靈敏、可靠的動(dòng)物模型。

［1］程凱，張杰.荷瘤鼠活體成像研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2011，17(21):3318-3321.

［2］Marx J.Imaging animal models live and in color［J］.Science，2003，302(5652):1880-1882.

［3］Paroo Z，Bollinger RA，Braasch DA，et al.Validating bioluminescence imaging as a high-throughput，quantitative modality for assessing tumor burden［J］.Mol Imaging，2004，3(2):117-124.

［4］Ntziachristos V，Ripoll J，Wang LV，et al.Looking and listening to light:the evolution of whole-body photonic imaging［J］.Nat Biotechnol，2005，23(3):313-320.

［5］Luker GD，Luker KE.Optical imaging:current applications and future directions［J］.J Nucl Med，2008，49(1):1-4.

［6］Dufort S，Sancey L，Wenk C，et al.Optical small animal imaging in the drug discovery process［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1798(12):2266-2273.

［7］Wu B，Piatkevich KD，Lionnet T，et al.Modern fluorescent proteins and imaging technologies to study gene expression，nuclear localization，and dynamics［J］.Curr Opin Cell Biol，2011，23(3):310-317.

［8］Misteli T，Spector DL.Applications of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology［J］.Nat Biotechnol，1997，15(10):961-964.

［9］Chalfie M，Tu Y，Euskirchen G，et al.Green fluorescent protein as a maker for gene expression［J］.Science，1994，263(5148):802-805.

［10］Goodwin PC.GFP biofluorescence:imaging gene expression and protein dynamics in living cells.Design considerations for a fluorescence imaging laboratory［J］.MethodsCell Biol，1999，58:343-367.

［11］Lippincott-Schwartz J，Patterson GH.Development and use of fluorescent protein markers in living cells［J］.Science，2003，300(5616):87-91.

［12］Roda A.Discovery and development of the green fluorescent protein，GFP:the 2008 Nobel Prize［J］.Anal Bioanal Chem，2010，396(5):1619-1622.

［13］李新穎，侯春梅，黎燕，等.基于活體成像的卵巢癌動(dòng)物模型的建立［J］.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2010，34(5):492-494.