殼聚糖膜對體外培養(yǎng)大鼠軟骨細胞增殖活性及分泌細胞外基質的影響

麥 果，王衛(wèi)星，賀 斌

(武漢大學人民醫(yī)院，武漢 430060)

殼聚糖是廣泛存在于自然界中的甲殼素衍生物，是由D-氨基葡聚糖與少量乙?；被暇厶峭ㄟ^β(1-4)糖苷鍵連接形成的氨基葡聚糖類似物，其結構類似于透明軟骨中的透明質酸、硫酸角質素等，并具有與他們類似的理化特性和生物學功能［1，2］，同時具有良好的生物兼容性和生物可降解性［3］。已有研究表明，關節(jié)腔內(nèi)注射殼聚糖可以促進軟骨細胞增殖，增加軟骨細胞密度［4］;軟骨細胞體外培養(yǎng)結果也表明，殼聚糖可以維持細胞表型，阻止軟骨細胞因長時間體外培養(yǎng)和傳代過多而出現(xiàn)的去分化現(xiàn)象［5］。因此，近年來新型生物材料——殼聚糖膜越來越受到廣大學者的關注，但其能否促進軟骨細胞增殖及分泌細胞外基質目前仍無相關報道。2011年3月～2012年5月，我們觀察了殼聚糖膜對體外培養(yǎng)大鼠軟骨細胞增殖及分泌細胞外基質的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠30只，SPF級，雌雄不限，1月齡，體質量(100±20)g，由武漢大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，許可證號:SYXK(鄂)2003_0013。DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清，美國Gibco公司;胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶，美國 Sigma公司;Real-time PCR引物，美國Invitrogen公司;CCK-8試劑盒，日本Dojindo公司;Collagen-2、Aggrecan一抗，美國 Cell Signal公司;β-actin一抗，美國Santa Cruz公司;免疫組化試劑盒，武漢博士德生物公司。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖膜的制備 將殼聚糖粉溶于1.5%的乙酸溶液中，配制成濃度為2%的溶液，過濾，將定量液體傾注于不銹鋼板上，60～70℃烘干取下，在1 mol/L的氫氧化鈉溶液中浸泡2 h，再用蒸餾水洗滌至中性，自然干燥，貯存于無色硅膠干燥器中，以界面出現(xiàn)良好折光面為樣品制備成功。

1.2.2 大鼠軟骨細胞體外培養(yǎng)及分組 將SD大鼠引頸處死，取大鼠膝關節(jié)軟骨組織，放入盛有DHanks液(含青—鏈雙抗)的青瓶內(nèi)，用PBS緩沖液漂洗3遍并去除組織上污染的血液。往青瓶內(nèi)加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液5 mL，然后用顯微剪刀將髓核組織剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的小碎塊，吸入離心管中，置于37℃空氣搖床中消化1 h。1000 r/min離心 5 min，棄上清，加入0.1% Ⅱ型膠原酶5 mL于無菌離心管內(nèi)，37℃下消化4 h。1000 r/min離心5 min，棄上清，加入3 mL DMEM/F12(含10%FBS)細胞培養(yǎng)液，輕輕吹打細胞將細胞懸液吸入25 mL細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入DMEM/F12(含10%FBS的 50 U/mL青霉素，50 μg/mL鏈霉素)培養(yǎng)基2 mL。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后首次換液，以后隔天換液1次。取對數(shù)生長期的傳2代軟骨細胞，隨機分成4組:培養(yǎng)于6孔板細胞組、種植于殼聚糖膜細胞組、PBS處理組、殼聚糖膜浸出液處理組。

1.2.3 體外培養(yǎng)軟骨細胞鑒定 取第2代培養(yǎng)軟骨細胞爬片，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌3次，每次3 min。晾干后滴加正常山羊血清封閉液室溫封閉20 min，晾干后滴加1∶150稀釋的Ⅱ型膠原單克隆抗體，4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次3 min。滴加生物素化二抗，37℃孵育20 min，PBS洗滌3次，每次3 min。滴加SABC試劑，37℃孵育20 min，PBS洗滌3次，每次5 min。滴加DAB顯色劑，顯微鏡下觀察控制顯色情況。沖洗、脫水、封片，光鏡下觀察拍照。

1.2.4 CCK-8法檢測軟骨細胞的增殖情況 將各組細胞置于0.25%胰蛋白酶中消化，制成單細胞懸液，1000 r/min離心5 min，棄上清，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×104/mL，接種于96孔板中。待細胞貼壁后采用無血清培養(yǎng)法培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)于6孔板細胞組、種植于殼聚糖膜細胞組加入細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，PBS處理組、殼聚糖膜浸出液處理組分別加入PBS、殼聚糖浸出液，將培養(yǎng)細胞置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，終止培養(yǎng)前2 h每孔加入CCK-8試劑20 μL，在酶標儀上檢測450 nm波長下各孔的吸光度值，重復6次。

1.2.5 Real-time PCR檢測軟骨細胞分泌細胞外基質 將各組細胞培養(yǎng)24 h后提取RNA。使用Trizol法提取，將RNA溶于DEPC處理的無菌水中，測定RNA的濃度(A260/A280＞1.8)以確保RNA的純度。應用大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)提供的RT試劑盒將提取的 mRNA逆轉錄為 cDNA。采用SYBR GreenⅠ染料進行標記，并通過ABI 7500 Real-time PCR系統(tǒng)對Ⅱ型膠原(Collagen-2)及聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的表達進行分析，引物序列如表1所示。PCR反應條件為:95℃變性10 s，95℃ 5 s，循環(huán)40次后，60℃延伸30 s。然后得到標準曲線，在本實驗中GAPDH作為內(nèi)參，通過與內(nèi)參的比較來得到各種基因的相對表達量。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以表示，結果比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 軟骨細胞體外培養(yǎng)及鑒定 自大鼠膝關節(jié)軟骨組織中分離培養(yǎng)的軟骨細胞，培養(yǎng)72 h后細胞生長狀態(tài)良好，可見細胞生長融合成片，形態(tài)呈鋪路石或多角形外觀。經(jīng)Collagen-2免疫組化染色確定該細胞可分泌Collagen-2，確定為軟骨細胞。見圖1。

圖1 軟骨細胞形態(tài)及鑒定

2.2 殼聚糖膜對軟骨細胞增殖的影響 與6孔板細胞組比較，種植于殼聚糖膜細胞組軟骨細胞增殖活性明顯增高(P＜0.05)，增殖活性增高55%。與PBS處理組比較，殼聚糖膜浸出液處理組軟骨細胞增殖活性明顯增高(P＜0.05)，增殖活性增高47%。見圖1。

圖2 殼聚糖膜對軟骨細胞增殖的影響

2.3 殼聚糖膜對軟骨細胞分泌細胞外基質的影響種植于殼聚糖膜細胞組、殼聚糖膜浸出液處理組軟骨細胞分泌細胞外基質Collagen-2、Aggrecan的量較6孔板細胞組、PBS處理組明顯增加(P均＜0.05)。種植于殼聚糖膜細胞組軟骨細胞分泌Collagen-2的量明顯高于6孔板細胞組，分泌量約提高57%;殼聚糖膜浸出液處理組軟骨細胞分泌Aggrecan的量明顯高于PBS處理組，分泌量約提高44%。見圖 3、4。

3 討論

圖3 殼聚糖膜對軟骨細胞表達Collagen-2的影響

圖4 殼聚糖膜對軟骨細胞表達Aggrecan的影響

骨關節(jié)炎(OA)是骨科的常見病、多發(fā)病之一，其病因目前尚不明確。有研究表明，軟骨細胞表型的改變在OA的發(fā)病中起著重要的作用，主要表現(xiàn)為軟骨細胞分泌及增殖活性降低。正常軟骨細胞的表型特點是細胞呈多邊形，具有合成、分泌Ⅱ型膠原和蛋白多糖的能力。軟骨損傷或病變后，由軟骨細胞分泌細胞外基質發(fā)揮修復作用。而炎癥刺激下的軟骨細胞表型發(fā)生變化，部分細胞呈梭形改變，Ⅱ型膠原和蛋白多糖合成減少，Ⅰ型膠原合成增加，其分泌的細胞外基質不能達到正常軟骨基質在組成及力學方面的要求，軟骨纖維化，基質鈣化，水分丟失，彈性下降，功能喪失，從而導致軟骨修復失敗。因此，穩(wěn)定軟骨細胞表型，促進細胞增殖及細胞分泌細胞外基質在OA的治療中具有重要的意義。

近年研究發(fā)現(xiàn)，甲殼素及其衍生物材料具有良好的親水性［6］，特別是殼聚糖，由于完全脫去了乙酰基，親水性很高，潤濕性很好。潤濕性越好、親水性越高，與分子接觸機會就越多，細胞在材料表明的附著也就越緊密、均勻，材料的界面結合就越好。殼聚糖具有很強的吸附能力，植入體內(nèi)后在其表明形成由水分子、氨基酸、蛋白質及多種離子構成的水結構層，有利于細胞與材料的結合，并為黏附受體反應提供了許多位點。殼聚糖具有剛性骨架和較強的分子間氫鍵，使得大分子具有有序結構和三種晶體結構;同時也具有較多的側位基團功能，可以在伯胺基、伯羥基、仲羥基上進行各種化學反應，也可以像纖維素一樣進行酯化、醚化、氧化、磺化以及一系列鉸鏈連接等反應。由于殼聚糖分子中存在一些游離的堿性-NH3基團，導致材料表面及其周圍的pH偏堿性。在偏堿性的環(huán)境里，細胞酶的活性水平較高，細胞生長處于活躍狀態(tài)，新生細胞增殖較快。因此，就可以使組織界面對細胞生長有利。

本研究結果表明，殼聚糖不僅能保證軟骨細胞在膜上的正常生長，還能促進其增殖，證實了殼聚糖膜不僅具有良好的生物兼容性，還具有一定的生物活性。本研究還發(fā)現(xiàn)，殼聚糖膜滲出液可以促進體外培養(yǎng)軟骨細胞增殖，并促進軟骨細胞分泌軟骨細胞細胞外基質Collagen-2與Aggrecan，而這2種大分子蛋白質是正常軟骨細胞分泌的主要細胞外基質，殼聚糖膜可促進其分泌則表明殼聚糖膜對軟骨細胞退變具有保護作用，這為將來殼聚糖膜應用于臨床治療OA提供了重要的實驗依據(jù)。目前關于殼聚糖促進細胞增殖的原因與機制還不是很明確，有學者認為［7］，殼聚糖因為結構特性與氨基葡聚糖相似，所以在功能上也與氨基葡聚糖相似。而氨基葡聚糖作為細胞外基質中重要的糖蛋白，在細胞附著、分化及形態(tài)發(fā)生中起著重要的作用。

綜上所述，在體外培養(yǎng)條件下，殼聚糖膜可以顯著促進軟骨細胞增殖與分泌細胞外基質。

［1］Suh JK，Matthew HW.Application of chitosan-based polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering:a review［J］.Biomaterials，2000，21(24):2589-2598.

［2］Aiba SI.Studies on chitosan:6.Relationship between N-acetyl group distribution pattern and chitinase digestibility of partially N-acetylated chitosans［J］.Int J Biol Macromol，1993，15(4):241-245.

［3］VandeVord PJ，Matthew HW，DeSilva SP，et al.Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice［J］.J Biomed Mater Res，2002，59(3):585-590.

［4］Lu JX，Prudhommeaux F，Meunier A，et al.Effect of chitosan on rat knee cartilage［J］.Biomaterials，1999，20(20):1937-1944.

［5］Lahiji A，Sohrabi A，Hungerford DS，et al.Chitosan supports the expression of extracellular matrix proteins in human osteoblasts and chondrocytes［J］.J Biomed Mater Res，2000，51(4):586-595.

［6］Piehler J，Brecht A，Geckeler KE，et al.Surface modification for direct immunoprobes［J］.Biosens Bioelectron，1996，11(6-7):579-590.

［7］Muzzarelli R，Baldassarre V，Conti F，et al.Biological activity of chitosan:ultrastructural study［J］.Biomaterials，1988，9(3):247-252.