腺病毒介導的鼠IL-10基因?qū)Ψ欠逝中吞悄虿⌒∈笠葝uβ細胞的保護作用

陳燕燕，張芳萍，宋 青，喬凌燕，劉 棟，田 飛，徐愛晶，陳志紅，李 堂

(1青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東 青島 266003;2青島市婦女兒童醫(yī)療保健中心;3靖江市人民醫(yī)院;4廣州市兒童醫(yī)院)

1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，是由炎性細胞和細胞因子等介導的胰島β細胞不斷破壞所致［1］。越來越多的研究認為，這種免疫破壞反應的致病機理是以1型T輔助細胞(Th1)免疫反應為基礎的。Th1細胞活性和產(chǎn)生的細胞因子能上調(diào)促炎因子不斷破壞胰島β細胞，導致1型糖尿病發(fā)生;而2型T輔助細胞(Th2)能下調(diào)Th1細胞活性，防止1型糖尿病發(fā)生。因此，Th1和Th2細胞亞群失衡是1型糖尿病發(fā)病的關鍵，Th2細胞因子(尤其是IL-10)被認為是一種針對1型糖尿病治療的有效細胞因子［2，3］。本課題組前期已經(jīng)證實，腺病毒介導的IL-10基因轉(zhuǎn)導入動物和人類胰腺的可行性［4］，并證實IL-10可以預防1型糖尿病的發(fā)生［5］。由于臨床上很難早期發(fā)現(xiàn)糖尿病，一旦發(fā)現(xiàn)往往已經(jīng)有大量的胰島β細胞破壞，因此迫切期待一種可以替代胰島素長期皮下注射、應用于臨床發(fā)病期的治療方法。2011年10月～2012年5月，我們觀察了腺病毒介導的鼠IL-10(Ad-rIL-10)基因轉(zhuǎn)移體對非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠1型糖尿病發(fā)病早期殘余胰島β細胞的保護作用，旨在為其臨床治療提供新思路?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級、雌性NOD/Lt小鼠 46只，4～5周齡，體質(zhì)量19～24 g，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2009-0004，在無病理條件下飼養(yǎng)于青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院動物房，自由進食、水。人胚腎293細胞由青島大學醫(yī)學院羅兵教授惠贈。含Ad-rIL-10和空載體(Ad-eGFP)的重組腺病毒液由青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院陳志紅副教授惠贈，其病毒滴度分別為1.0×109、8.0×108pfu/mL，培養(yǎng)293細胞并擴增腺病毒。環(huán)磷酰胺:德國ASTA Medica AG公司。熒光顯微鏡:日本Olympus公司。二氧化碳孵育箱:美國Forma Scientific公司?？焖傧俨《靖腥拘缘味葯z測試劑盒:北京本元正陽公司。小鼠 IFN-γ、IL-4、IL-10、C 肽ELISA試劑盒:美國R＆D公司。血糖儀:美國強生穩(wěn)豪型。DAB顯色試劑盒:福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及動物模型制備 隨機將小鼠分為4組:生理鹽水對照組10只、糖尿病對照組12只、空載體對照組12只、Ad-rIL-10組12只。糖尿病對照組、空載體對照組、Ad-rIL-10組分別在第1、14天腹腔注射環(huán)磷酰胺200 mg/(kg·次)誘導糖尿病發(fā)生［6］。每周檢測體質(zhì)量1次，注射環(huán)磷酰胺后第3、7天及以后每周檢測小鼠尾靜脈隨機血糖1次，觀察小鼠毛發(fā)光澤度及有無體質(zhì)量下降、多飲、多尿、多食現(xiàn)象，連續(xù) 2次隨機血糖大于 16.7 mmol/L即可確定糖尿病早期模型。

1.2.2 動物處理及標本制備 成模后，立即給予空載體對照組含Ad-eGFP的重組腺病毒液0.1 mL、Ad-rIL-10組含Ad-rIL-10的重組腺病毒液0.1 mL、其他組等量生理鹽水，腹腔注射1次。每周檢測小鼠體質(zhì)量、血糖。3周后處死所有小鼠，死前摘眼球留取血液標本，3000 r/min離心10 min，獲取血清標本，并立即提取胰腺，10%中性甲醛固定，獲得胰腺標本。

1.2.3 胰島炎癥浸潤程度的評估 胰腺標本石蠟包埋，切片并HE染色，光鏡觀察。胰島炎癥浸潤程度由專業(yè)病理人員采用雙盲法判定，分為以下4級:G0:胰島完整，無淋巴細胞浸潤;G1:淋巴細胞浸潤胰島的周邊或＜25%的胰島面積受累;G2:25% ～50%的胰島面積受累;G3:＞50%的胰島面積受累。按上述標準每組觀察5個×200倍鏡下胰腺切片。

1.2.4 胰腺IL-10局部表達情況 胰腺標本采用免疫組化SABC法觀察IL-10基因在胰腺局部的表達情況。細胞質(zhì)中呈棕黃色顆粒的為陽性細胞，計算陽性細胞百分比和染色強度。陽性細胞百分比:＜1%為0分，1% ～10%為1分，11% ～50%為2分，51% ～80%為3分，＞80%為4分;顆粒著色強度:無著色0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分。陽性細胞百分比和染色強度相乘，積為免疫組化得分，0分(－)，1～4分(+)，5～8分(++)，9～12分(+++)。

1.2.5 殘余胰島β細胞功能的檢測 血清C肽水平可以反映胰島β細胞分泌胰島素的能力。采用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)測定血清標本中C肽光密度(OD)值，根據(jù)OD值計算實際血清C肽含量。

1.2.6 血清 IL-10、IL-4及 IFN-γ 水平檢測 采用ELISA法檢測小鼠血清IFN-γ、IL-4及IL-10 OD值，根據(jù) OD值計算實際血清 IFN-γ、IL-4及 IL-10水平，了解機體是否存在Th亞群失衡。

1.2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間兩兩比較采用SNK檢驗，對等級分組資料進行H檢驗統(tǒng)計學分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IL-10對成模后小鼠血糖、體質(zhì)量的影響 糖尿病對照組、空載體對照組、Ad-rIL-10組腹腔注射環(huán)磷酰胺后，小鼠毛發(fā)光澤度逐漸下降，并出現(xiàn)血糖升高、體質(zhì)量下降、飲食飲水量增多、尿量增多等現(xiàn)象。生理鹽水對照組未出現(xiàn)死亡，成模后糖尿病對照組、Ad-rIL-10組各死亡4只，空載體對照組死亡3只。各組體質(zhì)量、血糖變化見表1、2。

2.2 IL-10在胰腺的局部表達情況 各組胰腺標本切片IL-10免疫組化分析顯示，Ad-rIL-10組胰腺標本光鏡下細胞內(nèi)棕黃色顆粒多、著色深，免疫組化得分為(4.75 ±1.49)分，高于生理鹽水對照組(2.10±1.10)、糖尿病對照組(2.63 ±1.19)、空載體對照組(2.89 ±1.05)(P 均 ＜0.05)。

表1 各組成模前后體質(zhì)量變化(g，)

表1 各組成模前后體質(zhì)量變化(g，)

注:與生理鹽水對照組比較，*P＜0.05

組別 n 成模前 成模后1周 2周 3周生理鹽水對照組 1022.64 ±1.7923.78 ±0.44 24.32 ±1.00 24.46 ±1.06糖尿病對照組 823.05 ±0.9921.94 ±1.50*21.85 ±1.49*21.62 ±1.20*Ad-rIL-10 組 822.65 ±0.7622.24 ±0.70*22.67 ±1.35*21.47 ±1.02*空載體對照組 922.46 ±2.5522.35 ±0.90*22.65 ±1.12*22.04 ±0.95*

表2 各組成模前后血糖變化(mmol/L，)

表2 各組成模前后血糖變化(mmol/L，)

注:與生理鹽水對照組比較，*P＜0.05

組別 n 成模前 成模后1周 2周 3周生理鹽水對照組10 5.97 ±0.465.96 ±0.37 6.20 ±0.59 6.58 ±0.78糖尿病對照組 8 5.95 ±0.2923.20 ±8.00*23.56 ±8.75*24.57 ±7.69*Ad-rIL-10 組 8 5.74 ±0.3724.48 ±6.76*25.16 ±6.08*27.00 ±6.70*空載體對照組 9 5.78 ±0.4824.66 ±6.95*23.79 ±6.70*25.22 ±6.70*

2.3 IL-10對胰島炎癥程度的影響 生理鹽水對照組小鼠胰島炎以G0、G1級為主，而其他組胰島炎以G2、G3級為主，鏡下可見胰腺細胞形態(tài)紊亂，胰島以及胰島周圍炎細胞浸潤明顯，以淋巴細胞浸潤為主，胰島小，數(shù)量少。

2.4 各組血清 C 肽、IL-4、IL-10、IFN-γ 水平比較見表3。

表3 各組血清 C 肽、IL-4、IL-10、IFN-γ 水平比較()

表3 各組血清 C 肽、IL-4、IL-10、IFN-γ 水平比較()

注:與生理鹽水對照組比較，*P＜0.05

組別 n C 肽(ng/mL) IL-4(pg/mL) IL-10(pg/mL) IFN-γ(pg/mL)生理鹽水對照組 10 5.108 ±0.739 86.90 ±14.93 260.10 ±55.16 253.35 ±22.84糖尿病對照組 8 3.840 ±0.243* 55.75 ± 8.88* 174.62 ±23.36* 353.36 ±28.82*Ad-rIL-10 組 8 4.050 ±0.195* 56.88 ± 8.37* 212.04 ±32.75* 374.00 ±17.39*空載體對照組 9 3.848 ±0.288* 58.22 ±10.21* 195.61 ±30.84* 354.46 ±40.40*

3 討論

環(huán)磷酰胺是一種具有細胞毒性的化療藥物，適應于淋巴細胞白血病、淋巴瘤和一些實體瘤的治療，同時也是一種免疫調(diào)節(jié)劑。研究表明，環(huán)磷酰胺可以加強免疫反應，加速 NOD小鼠糖尿病的發(fā)病［6，7］。Yasunami 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，分別給予兩組NOD小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，第1組腹腔注射環(huán)磷酰胺1次，第2組第1、14天腹腔注射小劑量環(huán)磷酰胺各1次，結果顯示，第1組小鼠第2周糖尿病的發(fā)病率為63.7%、4周后發(fā)病率為55.1%，而第2組小鼠第1次注射環(huán)磷酰胺2周糖尿病的發(fā)病率為72.7%，第2次注射2周發(fā)病率為100%。提示1次小劑量環(huán)磷酰胺可能在短期內(nèi)促進NOD小鼠發(fā)生1型糖尿病，但這種反應為可逆的，而2次小劑量環(huán)磷酰胺可提高小鼠1型糖尿病的發(fā)病率。本實驗中，小劑量環(huán)磷酰胺成功地誘導了NOD小鼠1型糖尿病發(fā)生，且誘發(fā)成功率較高，使本實驗小鼠發(fā)病時間同一化。

1型糖尿病的發(fā)病過程大致可歸納為以下3個階段:即Th細胞失衡階段、炎性細胞募集階段及效應階段。“免疫調(diào)節(jié)失衡學說”認為，Th1/Th2細胞亞群失衡和免疫功能紊亂是1型糖尿病的發(fā)病原因［8］。Th1 型細胞因子，如 IL-2、IFN-γ 和 TNF-β等，能上調(diào)促炎因子不斷破壞胰島β細胞;而Th2型細胞因子，如 IL-4、IL-10等，能下調(diào) Th1細胞活性，防止1型糖尿病的發(fā)生［9］。

IL-10是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，它可以抑制炎癥過程中的抗原提呈、炎性細胞激活和細胞因子分泌等環(huán)節(jié)，具有較強的免疫抑制作用［10］。IL-10不僅能抑制體內(nèi)外TNF-α、IL-1及氧自由基產(chǎn)物的形成，還能通過抑制抗原提呈細胞產(chǎn)生的IL-12來抑制Th1細胞產(chǎn)生的IFN-γ的釋放。但外源性IL-10在體內(nèi)的相對半衰期較短，需要不斷重復給藥，這就限制了重組IL-10蛋白的應用。結合轉(zhuǎn)基因技術，本課題組前期已經(jīng)成功構建了腺病毒介導的鼠IL-10基因轉(zhuǎn)移體，在體外感染胰島素分泌細胞系，可以在該細胞內(nèi)有效表達，在高糖刺激下仍具有分泌胰島素的功能，并且可以保護胰島β細胞免受促炎因子的破壞，表明這種轉(zhuǎn)移體并不影響細胞功能，具有較高的基因轉(zhuǎn)導效率，可以持續(xù)、穩(wěn)定的表達基因，安全性較高［3～5］。后期將其分別應用于4周齡和9周齡NOD小鼠的體內(nèi)試驗中發(fā)現(xiàn)，IL-10可以降低糖尿病的累積發(fā)病率、減輕胰島炎癥程度，延緩甚至防止1型糖尿病的發(fā)生。但是在臨床上很難早期發(fā)現(xiàn)糖尿病，一旦發(fā)現(xiàn)，往往胰島炎癥浸潤較重，殘余胰島β細胞較少。

本研究使用4～5周齡的NOD小鼠，胰島炎癥還未發(fā)生或處于胰島炎癥早期階段，采用環(huán)磷酰胺加速糖尿病發(fā)生，此時小鼠機體正處于Th細胞失衡階段，發(fā)病后立即給予IL-10基因轉(zhuǎn)移體，觀察IL-10是否能夠逆轉(zhuǎn)Th細胞亞群失衡、保護殘存胰島β細胞免受免疫破壞，從而阻止疾病的進展。結果顯示，與生理鹽水對照組比較，采用環(huán)磷酰胺誘導后小鼠出現(xiàn)血糖升高、體質(zhì)量下降、毛色無光澤、多飲、多尿、多食、激惹等現(xiàn)象，而且出現(xiàn)Th1/Th2細胞亞群失衡(IFN-γ水平升高，血清 IL-4、IL-10水平降低)、胰島素前體C肽水平降低，這些均表明環(huán)磷酰胺誘導了1型糖尿病早期成模，并且成模率較高。雖然Ad-rIL-10組胰腺局部高表達IL-10，但與其他模型組比較，IL-10在控制血糖、體質(zhì)量及胰島炎癥浸潤方面無明顯作用，不能增加C肽的分泌，未能逆轉(zhuǎn)機體免疫失衡狀態(tài)，這些結果提示，IL-10對于殘余胰島β細胞無明顯保護作用。盡管有研究認為，IL-10基因轉(zhuǎn)移體能在胰腺高表達，可下調(diào)Th1樣細胞因子活性，起到調(diào)節(jié)機體免疫微環(huán)境的作用，進而阻止糖尿病的進展。但我們的實驗結論與之不符，考慮原因可能為:環(huán)磷酰胺誘導糖尿病發(fā)病后，相當于臨床發(fā)病早期，此時機體早已經(jīng)出現(xiàn)嚴重的免疫代謝紊亂，已有大量的胰島β細胞破壞，通過單一因素IL-10進行免疫干預，不足以逆轉(zhuǎn)此免疫紊亂，而殘余胰島β細胞繼續(xù)進行性破壞。

在本實驗環(huán)磷酰胺加速NOD小鼠發(fā)病的過程中，存在小鼠死亡的現(xiàn)象，除了血糖過高的原因外，是否與環(huán)磷酰胺的細胞毒性作用對NOD小鼠機體打擊過大有關，有待進一步明確環(huán)磷酰胺加速NOD小鼠發(fā)病的安全性。

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