復(fù)合肝素及CD34抗體可降解鎂合金支架在心肌血運(yùn)重建中的應(yīng)用

張 嵬，楊 力，劉曉程，張杰民，陳 越，張亞東

(天津醫(yī)科大學(xué)心血管病臨床學(xué)院、泰達(dá)國(guó)際心血管病醫(yī)院，天津 300457)

冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入是當(dāng)前治療冠心病的主要手段，但是對(duì)于彌漫性病變的患者并不適于用上述的方式重建心肌血運(yùn)。心肌打孔治療是終末期冠心病的一種治療方式，然而人工腔道的閉塞卻嚴(yán)重影響了該治療方式的效果。目前有研究顯示，心肌鉆孔合并心室支架植入的方法重建缺血心肌血運(yùn)取得了一定的研究成果［1～3］。2011年11月～2012年6月，我們應(yīng)用鎂合金替代以前應(yīng)用的聚乳酸/乙醇酸制成新型的可降解心室支架，同時(shí)復(fù)合肝素及CD34抗體，以期增加支架強(qiáng)度，保持支架通暢，促進(jìn)腔道內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，從而有效地重建心肌血運(yùn)。

1 材料與方法

1.1 材料 vWF鼠抗人單克隆抗體、羊抗鼠IgG多克隆抗體(Dako公司，丹麥);顯微鏡攝像系統(tǒng)(BX51，OLYMPUS公司，日本);經(jīng)圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0(MediaCybernetics，美國(guó));中華實(shí)驗(yàn)用小型豬(購自北京琉璃河科興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心);麻醉機(jī)、心電監(jiān)護(hù)儀(Detax-Ohmeda 700，美國(guó));高速機(jī)械打孔器(北京凱邁醫(yī)療設(shè)備公司)

1.2 方法

1.2.1 豬急性心肌梗死模型及鎂合金支架的制備①模型建立:選用中華實(shí)驗(yàn)小型豬18只，肌注鹽酸賽拉嗪(2 mg/kg)誘導(dǎo)麻醉，然后氣管插管，呼吸機(jī)輔助通氣(潮氣量350 mL，呼吸頻率15次/min，氧流量1 L/min)。術(shù)中吸入1%～2%異氟醚，靜脈持續(xù)泵入丙泊酚3 mg/(kg·h)維持麻醉，持續(xù)進(jìn)行心電監(jiān)護(hù)。經(jīng)胸骨正中切口暴露心臟，結(jié)扎冠脈前降支中、遠(yuǎn)端1/3交界處，通過心電圖確定心肌梗死模型制作成功。心肌梗死模型制作成功后，將動(dòng)物隨機(jī)分為3組(每組6只):A組為對(duì)照組，B組為心肌打孔+復(fù)合緩釋肝素的可降解鎂合金支架植入組，C組為心肌打孔+復(fù)合緩釋肝素和CD34抗體的可降解鎂合金支架植入組。在B組和C組中，于心肌梗死區(qū)采用自制高速鉆孔器(13000 r/min)由心外膜各打兩個(gè)透壁孔道。每個(gè)孔道內(nèi)植入1枚可降解的管形支架，隨即結(jié)扎心外膜預(yù)留的荷包縫線控制出血并固定支架。術(shù)后肌注青霉素300萬U，2次/d，連續(xù)3 d。②鎂合金支架的制備:支架由鎂鋅合金制成，直徑2 mm，厚度0.15 mm，長(zhǎng)度10 mm，分別涂覆肝素及CD34抗體。每個(gè)鎂合金支架復(fù)合肝素約500 μg，控釋作用可持續(xù)6個(gè)月左右。鎂合金支架的抗壓性測(cè)試結(jié)果顯示，支架的徑向抗壓性能為75 kPa，能滿足支架植入心肌的要求。降解時(shí)間測(cè)試結(jié)果顯示，鎂合金支架體外降解時(shí)間1個(gè)月以上。

1.2.2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 圖像采集應(yīng)用GE 33超聲心動(dòng)儀，S3探頭頻率為1.6～3.2 MHz，同步記錄ECG。分別于心尖兩腔、四腔、左心室長(zhǎng)短軸切面采集資料存盤，脫機(jī)測(cè)量左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)，計(jì)算LVEF=(LVEDV－LVESV)/LVEDV×100%。

1.2.3 核素心肌灌注顯像 心肌梗死模型建成后即刻和術(shù)后6周時(shí)經(jīng)豬耳緣靜脈注射14.8 MBq/kg99mTc—甲氧基異丁基異腈，給藥30 min后行心電門控心肌灌注核素顯像。儀器為GE Millennium VG-5，配低能通用型準(zhǔn)直器，兩個(gè)探頭呈90°夾角，繞心臟旋轉(zhuǎn)180°，每幀采集25 s，共采集30幀，矩陣64×64，放大倍數(shù)2.0。采用濾波反投影重建原始圖像。通過Emory Cardiac Toolbox軟件量化灌注質(zhì)量缺損百分率(MDP)的變化，其中MDP=(Md/Mt)×100%。Md指灌注缺損部位心肌質(zhì)量，Mt指整個(gè)心肌質(zhì)量。以每只動(dòng)物治療前和治療后6周時(shí)MDP的差值(△MDP)，作為衡量各組血流灌注情況改善的指標(biāo)。

1.2.4 新生血管密度的量化分析 上述圖像采集結(jié)束后，靜脈注射100 g/L的KCl 10 mL使心臟停搏于舒張期。從孔道周圍隨機(jī)采集組織標(biāo)本，依次經(jīng)40 g/L的甲醛固定24 h、脫水、浸蠟、包埋及切片(5 μm)后，常規(guī)行HE染色與免疫組織化學(xué)染色。后者的主要步驟為:切片以30 ml/L的H2O2阻斷，滴加正常羊血清封閉，依次滴加小鼠抗人血管性血友病因子單克隆抗體(4℃過夜)及二抗羊抗小鼠IgG多克隆抗體，加DAB顯色后，蘇木素復(fù)染。在放大倍率、曝光時(shí)間均相同的條件下，每組隨機(jī)采集50個(gè)非重疊視野圖像，轉(zhuǎn)化為Tiff格式保存，經(jīng)圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0處理，校正A值后進(jìn)行量化分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析。P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況 本實(shí)驗(yàn)選用中華小型豬18只建立心肌梗死模型，4只在結(jié)扎冠脈后出現(xiàn)室顫，予電除顫后均復(fù)律，全組無死亡。支架植入組6周內(nèi)各臟器均未發(fā)現(xiàn)栓塞，提示無支架殘余脫落。

2.2 超聲心動(dòng)圖檢查 心梗模型制作成功后即可見相應(yīng)部位的局部室壁運(yùn)動(dòng)減弱。治療前各組LVEF無明顯差異。術(shù)后6周時(shí)檢查結(jié)果顯示，C組、B組LVEF分別為(53±2)%、(47±3)%，均高于A組［(43±3)%］，三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。

2.3 核素心肌灌注顯像測(cè)定 治療6周，B組和C組的△MDP值分別為(－1.43±0.47)%和(－1.47±0.82)%，明顯低于 A 組［(2.75 ±0.24)%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。C組的△MDP略低于B組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A、B、C 3組的短軸核素心肌灌注掃描結(jié)果顯示，治療后6周時(shí)心肌灌注缺損面積較治療前明顯改善。見圖1。

圖1 三組治療前和治療后6周心肌灌注核素掃描顯像垂直短軸圖像

2.4 組織學(xué)分析 6周后心臟組織學(xué)檢查見A、B、C 3組的人工腔道基本上完全閉鎖，鎂合金支架全部被吸收，孔道周圍形成少量的瘢痕組織。6周后，通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)缺血心肌組織中新生血管密度的變化。經(jīng)圖像分析軟件量化分析后顯示，治療后6周B組、C組新生血管密度OD值為5381±76和5682±29，較A組(2873±59)明顯增加(P均＜0.01)。A組和B組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

3 討論

心肌打孔是有效的心肌再血管化方法之一，其治療的理論基礎(chǔ)是左心室腔內(nèi)的動(dòng)脈血可以通過孔道灌注到心肌竇狀隙，從而營(yíng)養(yǎng)與支持心肌細(xì)胞［4］。但是目前的研究結(jié)果表明，無論激光打孔還是機(jī)械打孔，都無法維持孔道的長(zhǎng)期開放［5］。本實(shí)驗(yàn)所采用的鎂合金支架抗壓性能好，可以維持腔道處于持續(xù)開放狀態(tài)。此外，支架由可降解的鎂合金材料制成，控制肝素與CD34抗體持續(xù)緩慢釋放，發(fā)揮其在局部持續(xù)抑制凝血途徑的激活和誘導(dǎo)微血管形成及微循環(huán)重建的作用。CD34于1984年由美國(guó)科學(xué)家Civin發(fā)現(xiàn)，屬于鈣黏蛋白家族，其結(jié)構(gòu)包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞質(zhì)區(qū)3部分［6］。CD34是內(nèi)皮祖細(xì)胞上的一個(gè)相對(duì)特異的表面抗原，參與了內(nèi)皮祖細(xì)胞的定位與黏附。抗CD34抗體能夠特異識(shí)別細(xì)胞，并通過抗原抗體結(jié)合原理從外周血中募集內(nèi)皮祖細(xì)胞。Rotmans等［7］證實(shí)在血管材料上預(yù)置CD34抗體可通過抗原抗體反應(yīng)的原理捕獲循環(huán)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞，而內(nèi)皮祖細(xì)胞在一定條件下可進(jìn)一步分化成內(nèi)皮細(xì)胞。此外，美國(guó)Orbus Medical Technologies公司所研制成功的Genous生物工程R支架就是在不銹鋼冠脈支架上涂覆一層含有CD34抗體的基質(zhì)成分。研究證實(shí)，該種支架可促進(jìn)內(nèi)膜損傷處的修復(fù)和支架表面的早期內(nèi)皮化，并取得了較好的短期臨床效果。我們將CD34抗體復(fù)合到支架上使其在短期內(nèi)發(fā)揮捕獲循環(huán)中內(nèi)皮祖細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞種植并加速細(xì)胞分化，在人工腔道內(nèi)生長(zhǎng)出內(nèi)皮細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在治療后6周支架全部吸收，未見殘余及臟器栓塞，證實(shí)了鎂合金支架的安全性。但是，支架所形成的人工腔道為纖維組織所填充，未見明顯的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，人工腔道完全閉鎖。因此，本實(shí)驗(yàn)研究并沒有達(dá)到預(yù)期的目的，缺血心肌內(nèi)沒有形成被覆內(nèi)皮細(xì)胞的人工腔道。上述結(jié)果說明，鎂合金支架內(nèi)雖含有緩釋肝素，卻沒有抑制腔道內(nèi)血栓的形成，考慮此與人工腔道直徑偏小、無法抑制內(nèi)外源凝血機(jī)制有關(guān)。再者，CD+34細(xì)胞僅占骨髓單核細(xì)胞的1.5%，在外周血中的比例低于0.5%，內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量太低以致于無法發(fā)揮其效應(yīng)。綜合考慮上述可能造成腔道閉鎖的原因可為今后支架的改進(jìn)提供思路。首先，增加支架的內(nèi)徑至3 mm或以上;其次，利用一些能夠影響外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞濃度的細(xì)胞因子或藥物，如GM-CSF、G-CSF、促紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和他汀類藥物等促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員，增加被捕捉細(xì)胞的數(shù)量，從而促進(jìn)腔道的內(nèi)皮化［8］。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，復(fù)合肝素和CD34抗體的可降解鎂合金支架植入心肌梗死區(qū)后，能夠顯著增加缺血心肌的新生血管密度，增加缺血部位心肌的灌注，進(jìn)而改善心臟的功能，說明可降解鎂合金支架植入對(duì)急性心肌梗死具有積極的治療作用。

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