兩用核不育系P88S愈傷組織的誘導(dǎo)及其遺傳轉(zhuǎn)化研究

崔 看 ，成 平 ，陳 錦 ，袁定陽 ，夏石頭

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，植物激素與生長發(fā)育湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.湖南省農(nóng)業(yè)信息與工程研究所，湖南 長沙 410125；3.雜交水稻國家重點實驗室，湖南 長沙 410125）

水稻（Oryza sativa L.）是人類最重要的糧食作物之一，傳統(tǒng)遺傳育種技術(shù)在提高水稻產(chǎn)量和改善米質(zhì)等方面做出了巨大貢獻[1]。但由于生態(tài)環(huán)境惡化和水稻種質(zhì)資源匱乏的限制，傳統(tǒng)的遺傳改良方法已經(jīng)不能夠滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對新型種質(zhì)資源的需求。P88S是由湖南雜交水稻研究中心羅孝和研究員在2003年利用雙向系選（在長沙長日低溫的條件下選不育，在海南短日低溫下選相對可育）和溫光加再生強化選擇而選育出的異交結(jié)實率高、配合力強的超級雜交水稻兩用核不育系，在超級稻生產(chǎn)上得到了廣泛應(yīng)用，但其對稻瘟病抗性較弱[2-3]。利用基因工程技術(shù)將植物抗病性狀相關(guān)基因?qū)胨净蚪M中，可以作為獲得新種質(zhì)資源的一種重要手段，在實現(xiàn)超級稻高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗、穩(wěn)產(chǎn)目標(biāo)中發(fā)揮重要作用[4]。文章以兩用核不育系P88S為材料，研究了其愈傷組織的誘導(dǎo)及植物抗病基因snc1在其愈傷組織中的遺傳轉(zhuǎn)化，以期通過誘導(dǎo)、分化和繼代培養(yǎng)獲得高抗病超級稻新種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

超級雜交水稻兩用核不育系P88S，由湖南雜交水稻研究中心羅孝和研究員提供；遺傳轉(zhuǎn)化載體為夏石頭教授課題組改造的pG229質(zhì)粒，含有Kan+與Basta雙重抗性標(biāo)記；供體菌為農(nóng)桿菌EHA105，功能獲得型突變基因Atsnc1[5]，由加拿大英屬哥倫比亞大學(xué)Michael Smith Laboratories李昕教授實驗室惠贈。

1.2 方法

1.2.1 P88S愈傷組織的誘導(dǎo) 采取完全隨機化設(shè)計，參照文獻[6-7]選用4種誘導(dǎo)培養(yǎng)基MB、N6、NB和NMB進行愈傷組織誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)，將P88S成熟胚分別接種于 MB、N6、NB、NMB 4種培養(yǎng)基上進行愈傷組織的誘導(dǎo)，2,4-D濃度分別設(shè)為2.0、2.5、3.0 mg/L，6-BA 的濃度分別設(shè)為 0.1、0.2、0.3 mg/L，并添加0.5 g/L酸水解酪蛋白（CH）和脯氨酸（Pro）。誘導(dǎo)7 d或繼代培養(yǎng)12 d后，分別統(tǒng)計芽長、愈傷組織重量和誘導(dǎo)率等性狀，以篩選出最適合P88S愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基與最適生長物質(zhì)濃度配比。

1.2.2 遺傳轉(zhuǎn)化植株的獲得與檢測 農(nóng)桿菌的浸染轉(zhuǎn)化、抗性愈傷組織的篩選、轉(zhuǎn)化植株的檢測按照成平等[8]方法，轉(zhuǎn)化植株的檢測采用試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），提取轉(zhuǎn)化植株的DNA，進行PCR檢測。正向引物序列為：GTGGAGTTCCCATCTGAACATC，反向引物序列為：CCCATTTTGATTGCTGGAAAG。

2 結(jié)果與分析

2.1 P88S愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)母液的篩選

將 P88S的成熟胚分別接種于 MB、N6、NB、NMB培養(yǎng)基上（含3.0 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L 6-BA+0.5 g/L酸水解酪蛋白+0.5 g/L脯氨酸）誘導(dǎo)7 d后，觀察和統(tǒng)計各培養(yǎng)基上愈傷組織的顏色、重量和芽長等。試驗結(jié)果如表1所示，P88S在MB、NMB、N6培養(yǎng)基上誘導(dǎo)時，愈傷組織顏色淡黃，顆粒圓潤飽滿，而在NB培養(yǎng)基上誘導(dǎo)時，愈傷組織顆粒有褐化現(xiàn)象且顆粒較小。如圖1所示，P88S在MB培養(yǎng)基上P88S誘導(dǎo)的芽最長，為2.797 cm，比在 N6、NB、NMB 培養(yǎng)基上分別高出 0.749、0.821、0.887 cm，差異達到極顯著水平；在NB培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的P88S愈傷組織重量最輕，為0.004 6 g，極顯著低于其余3種培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織；NMB培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最高，達95.66%，極顯著高于MB培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率。綜合考慮各因素，NMB培養(yǎng)基是最適合P88S愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

表1 P88S愈傷組織在不同培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的芽長、愈傷組織重量和誘導(dǎo)率

2.2 P88S愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中植物生長物質(zhì)濃度的選擇

不同濃度2,4-D與6-BA對P88S愈傷組織誘導(dǎo)的影響如表2所示，不同濃度的2,4-D對于P88S芽長的影響不顯著，而對于愈傷組織重量的影響差異達到極顯著水平，當(dāng)2,4-D質(zhì)量濃度為3.0 mg/L時，P88S愈傷組織重量最大，平均達0.011 g，極顯著高于其他2個濃度處理的愈傷組織重量。當(dāng)添加3.0 mg/L的2,4-D時，誘導(dǎo)率達到94.70%，極顯著高于添加2.5 mg/L 2,4-D時的誘導(dǎo)率，表明2,4-D質(zhì)量濃度對P88S愈傷組織誘導(dǎo)率的有重要影響。而6-BA對芽長的影響明顯，濃度為0.3 mg/L 6-BA處理的芽長極顯著高于其他2個濃度處理的芽長，其愈傷組織誘導(dǎo)率與0.2 mg/L 6-BA處理的愈傷組織誘導(dǎo)率相近，但顯著高于0.1 mg/L 6-BA處理的愈傷組織誘導(dǎo)率。綜合考慮各因素，確定2,4-D最適質(zhì)量濃度為3.0 mg/L，6-BA最適質(zhì)量濃度為0.2 mg/L。

表2 2,4-D和6-BA對P88S愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 酸水解酪蛋白和脯氨酸對水稻成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

根據(jù)愈傷組織對滲透壓的要求，在試驗中添加了 0.5 g/L酸水解酪蛋白（CH）和脯氨酸（Pro），統(tǒng)計結(jié)果表明，添加CH和Pro的培養(yǎng)基，芽長為2.103 cm，愈傷組織重量為0.011 2 g，誘導(dǎo)率為94.75%；不添加CH和Pro的培養(yǎng)基，芽長為2.690 cm，愈傷組織重量為0.006 9 g，誘導(dǎo)率為91.83%。與不添加CH和Pro相比，添加CH和Pro的培養(yǎng)基芽長較短，其誘導(dǎo)率稍高，并能顯著提高愈傷組織的質(zhì)量。且添加CH和Pro后，愈傷組織生長旺盛，顆粒圓潤，顏色嫩黃鮮艷；而不添加CH和Pro，愈傷組織生長狀態(tài)較差，顆粒干癟較小，且有褐化現(xiàn)象。

2.4 P88S愈傷組織最適繼代培養(yǎng)基的確定

愈傷組織一般都要繼代1次，即培養(yǎng)約12d后才進行轉(zhuǎn)化，且轉(zhuǎn)化前會將愈傷組織一分為二，造成一定創(chuàng)傷以有利于農(nóng)桿菌的浸染。在對同一批愈傷組織進行MB、N6、NB、NMB培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，并觀測繼代培養(yǎng)生長和增重情況后，發(fā)現(xiàn)NMB培養(yǎng)基是P88S愈傷組織繼代培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基，其增重最大，為0.233 g，增重達185%，極顯著高于N6和NB培養(yǎng)基上愈傷組織的增重（圖1）。

2.5 P88S愈傷組織最適分化培養(yǎng)基的確定

分化培養(yǎng)的目的是讓愈傷組織重新分化成小苗，比較研究了DL和NMB兩種母液對P88S愈傷組織分化的影響，試驗結(jié)果表明，不同碳源對愈傷組織分化有一定影響，以麥芽糖作為碳源時，分化啟動較快，愈傷組織生長較迅速，7d左右就可見新的愈傷組織小顆粒，且愈傷組織緊致，綠豆大小的顆粒，出綠點時間為10～15d；以蔗糖作為碳源時，愈傷組織生長緩慢，一般2個星期左右才會有新愈傷組織，且愈傷組織松散，一夾即碎，出綠點時間為15～20d。P88S在DL分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)25d后分化出芽，而在NMB分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)25d后，愈傷組織有褐化死亡的跡象，且僅有部分愈傷組織出現(xiàn)綠點。因此，選用麥芽糖為碳源的DL分化培養(yǎng)基作為P88S的最適分化培養(yǎng)基。

2.6 遺傳轉(zhuǎn)化植株的獲得與檢測

當(dāng)分化培養(yǎng)基中綠芽長到長于2 cm后，將其從愈傷組織上剝離，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中。大約2周幼苗就長出完整的根系，加水煉苗2～3d后將其移出，洗凈掉根上的培養(yǎng)基，剪掉變黃的葉子，移栽到稻田土中（其轉(zhuǎn)化流程見圖2）。遺傳轉(zhuǎn)化植株驗證時，取移栽到稻田土中T0代轉(zhuǎn)化植株葉片，用試劑盒法提取小量DNA，利用snc1基因的特異引物進行PCR擴增檢測5株P(guān)88S轉(zhuǎn)化植株，結(jié)果顯示P88ST0-5中檢測到了目的基因snc1的存在（圖2中h）。

3 結(jié)論與討論

以超級雜交水稻兩用核不育系P88S為材料，研究發(fā)現(xiàn)P88S成熟胚愈傷組織的最適誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基是NMB培養(yǎng)基，其中2,4-D和6-BA的最適濃度分別為3.0 mg/L和0.2 mg/L，而添加0.5 g/L的酸水解酪蛋白和脯氨酸有利于愈傷組織的誘導(dǎo)。P88S成熟胚愈傷組織的最適分化培養(yǎng)基是DL分化培養(yǎng)基，麥芽糖為抗性愈傷組織分化的最適碳源。并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法共獲得5株轉(zhuǎn)化稻株，經(jīng)PCR檢測其中1株含目的基因s nc1。

擬南芥 SNC1（suppressor of npr1-1，constitutive1）基因[5]是一種重要的水楊酸誘導(dǎo)型廣譜抗病基因，該基因功能獲得型突變導(dǎo)致snc1突變體植株組成性表達病程相關(guān)蛋白，能夠組成性激活植物的抗病機制，并對細菌病原體Pseudomonas syringae pv maculicola ES4326（P.s.m.ES4326）和卵菌病原體 Hyaloperonospora arabidopsidis Noco2（H.a.Noco2）等病原物產(chǎn)生廣譜抗性。因為Atsnc1基因是一種獲得功能型突變基因，可以組成性表達致病機理相關(guān)（PR）基因，從而激活抗病性反應(yīng)，P88S轉(zhuǎn)化稻株中snc1基因是否有同樣的生理功能，還有待進一步研究。

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