用DGGE技術(shù)分析植物乳桿菌對(duì)小鼠腸道菌群失調(diào)的影響

李 藝，孟 鎮(zhèn)，鐘其頂，仇 凱，熊正河，*，欒同青，3，張澤生

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027；3.山東輕工業(yè)學(xué)院，山東濟(jì)南250353）

抗生素使用不當(dāng)已成為引起腸道菌群失調(diào)的最常見(jiàn)誘因[1]，抗生素在抑制或殺死致病菌的同時(shí)，也常同時(shí)損傷正常菌群，造成不同程度的菌群失調(diào)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，益生菌產(chǎn)品能有效預(yù)防和治療抗生素引起的菌群失調(diào)。植物乳桿菌作為益生菌中重要的一個(gè)成員其調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)的作用已經(jīng)被證明，并廣泛用于乳品、藥品及果蔬類產(chǎn)品的發(fā)酵[2-3]。

植物乳桿菌對(duì)腸道菌群作用效應(yīng)本質(zhì)上為腸道微生態(tài)區(qū)系的變化。立足于微生態(tài)學(xué)觀點(diǎn)，研究植物乳桿菌對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)及腸道菌群的演替，對(duì)植物乳桿菌功能的研究具有重要的意義。腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)十分復(fù)雜，腸道中絕大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)需要厭氧環(huán)境，而目前的厭氧培養(yǎng)技術(shù)不足以觀察腸道菌群的多態(tài)性及動(dòng)態(tài)變化。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為研究動(dòng)物腸道微生態(tài)提供了簡(jiǎn)便而快捷的方法[4-5]。其中DGGE技術(shù)近年來(lái)逐漸被應(yīng)用于檢測(cè)動(dòng)物胃腸道主要細(xì)菌類群的多態(tài)性[6-9]，從而更加全面準(zhǔn)確地反映復(fù)雜腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)多樣性。

目前，關(guān)于植物乳桿菌對(duì)腸道菌群失調(diào)作用的評(píng)價(jià)仍然很大程度上依賴選擇性培養(yǎng)方式[10-11]，并且大多數(shù)研究比較集中于益生菌的作用效果上[10-12]。而有關(guān)益生菌調(diào)節(jié)過(guò)程中腸道菌群的整體變化的研究鮮有報(bào)道，這些信息的缺失使菌群整體性變化的研究無(wú)法展開(kāi)，成為揭示腸道菌群演替與各種病理狀態(tài)關(guān)系的瓶頸。本研究利用DGGE技術(shù)研究植物乳桿菌對(duì)抗生素相關(guān)性腸道菌群失調(diào)的調(diào)整過(guò)程，研究抗生素、植物乳桿菌與腸道菌群變化的關(guān)系，并對(duì)頭孢地尼的耐藥菌株及抗生素相關(guān)性腹瀉的致病菌進(jìn)行初步研究。為進(jìn)一步研究益生菌作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌 昂立公司；昆明小鼠，雌性，體重（18±2）g 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；乳桿菌選擇性培養(yǎng)基（MRS）、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB）、腸球菌瓊脂、腦心浸液瓊脂（BHI）北京陸橋技術(shù)有限公司；引物F338GC/R518、F338/R518、M13F/M13R、dNTPs、X-gal、IPTG 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；TransTaqTM HiFi DNA Polymerase、DNA純化試劑盒、pEASY-T3 Cloning Kit、Trans1-T1 北京全式金生物科技有限公司；溶菌酶、蛋白酶K、SDS 北京全新拓達(dá)科技有限公司；去離子甲酰胺、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、N，N，N’，N’-四甲基二乙胺 Sigma公司。

恒溫生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；高速冷凍離心機(jī) Sigma公司；梯度PCR儀 Biometra公司；水平電泳儀 北京六一儀器廠；凝膠成像儀 Vilber lourmat公司；變性梯度凝膠電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及菌群失調(diào)模型的建立 小鼠20只，靜養(yǎng)1d適應(yīng)環(huán)境后，按體重隨機(jī)分為兩組，即正常對(duì)照組、植物乳桿菌治療組，每組各10只，單獨(dú)喂養(yǎng)。正常對(duì)照組灌胃生理鹽水；植物乳桿菌治療組灌50mg/mL頭孢地尼水溶液0.2mL/次，每天2次，時(shí)間間隔6h，連續(xù)5d后，收集糞便做腸道菌群分析。之后，植物乳桿菌治療組灌胃植物乳桿菌溶液（109CFU/mL），連續(xù)5d，每天收集糞便樣品。

1.2.2 小鼠糞便活菌計(jì)數(shù) 無(wú)菌稱取小鼠糞便，經(jīng)10倍倍比稀釋后，選擇合適濃度在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)計(jì)數(shù)，每個(gè)濃度重復(fù)3次。以下培養(yǎng)基用于活菌計(jì)數(shù)檢測(cè)：BHI Agar用于厭氧總菌培養(yǎng)；MRS用于乳桿菌的選擇培養(yǎng)；BSM由MRS添加0.05%（w/v）鹽酸半胱氨酸及0.05%（w/v）莫匹羅星后制得，用于雙歧桿菌的選擇培養(yǎng)；腸球菌瓊脂培養(yǎng)基用于腸球菌培養(yǎng)；EMB培養(yǎng)基用于兼性厭氧腸桿菌培養(yǎng)。BHI平板、MRS平板及BSM平板置于37℃厭氧條件下培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)；腸球菌瓊脂平板、EMB平板置于37℃有氧條件下培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)，數(shù)據(jù)以CFU/g表示。

1.2.3 小鼠糞便DNA的提取及PCR擴(kuò)增 糞便菌群總DNA的提取方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。提取的DNA通過(guò)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其DNA完整性。以16S rDNA可變區(qū)V3區(qū)為靶標(biāo)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物：F338-GC：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC GGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，下劃線部分為GC夾；下游引物R518：5’-ATTAC CGCGGCTGCTGG-3’PCR反應(yīng)體系為：總反應(yīng)體積為50μL，其中包括10×Buffer（Mg2+）5μL，10mmol/L dNTP混合液1μL，10mmol/L引物各1μL，模板1μL，Taq酶0.3μL，加雙蒸水ddH2O至50μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μL加3μL的溴酚藍(lán)，混勻，用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，恒壓80V 1h，EB染色15min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下成像，保存圖譜。

1.2.4 DGGE電泳及染色 參照Muyzer等[14]方法，對(duì)16S rDNA V3可變區(qū)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。DGGE使用8%聚丙烯酰胺凝膠，將100%變性梯度定義為含40%（v/v）甲酰胺和7mol/L尿素，變性梯度為30%～60%，電泳條件如下：60℃20V電壓下預(yù)電泳30min，隨后在60V的固定電壓下電泳16h。電泳結(jié)束后，進(jìn)行EB染色。DGGE凝膠切膠并采用Qantity One（Bio-Rad）進(jìn)行相似性和多樣性分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，不同實(shí)驗(yàn)組之間的差異分析采用Student—t檢驗(yàn)，p＜0.05為差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.01為差異有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 糞便活菌計(jì)數(shù)

昆明雌性小鼠經(jīng)頭孢地尼灌胃處理5d后，乳桿菌和厭氧總菌明顯減少，而且未檢測(cè)到雙歧桿菌、腸球菌和腸桿菌，說(shuō)明造模成功，如表1所示。

表1 小鼠糞便菌群檢測(cè)結(jié)果比較（lg CFU/g標(biāo)本，均值±SD）Table 1 The comparison of fecal microflora detection result（lg CFU/g sample,mean±SD）

2.2 靶標(biāo)16S DNA的V3區(qū)通用引物PCR-DGGE分析

小鼠糞便細(xì)菌的16S rDNA V3區(qū)的DGGE圖譜及聚類分析見(jiàn)圖1。圖1中不同位置的條帶代表不同的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，亮度反映出細(xì)菌相對(duì)量的多少?？股毓辔盖暗恼Ｐ∈笥写罅織l帶存在，說(shuō)明正常的腸道存在大量的細(xì)菌，用其制備動(dòng)物模型，對(duì)腸道菌群進(jìn)行相關(guān)研究具備可行性。抗生素連續(xù)處理5d后DGGE圖譜顯示條帶數(shù)量顯著減少，說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間大量抗生素處理能夠殺滅腸道中的大部分細(xì)菌。

圖1 小鼠糞便細(xì)菌微生物區(qū)系16S rDNA V3區(qū)引物的DGGE圖譜Fig.1 DGGE profiles obtained with universal primers V3 of 16S rDNA of fecal microbiota

圖2 UPGMA相似性聚類分析Fig.2 UPGMA cluster analysis for similarity coefficients

DGGE圖譜中條帶的差別可以很好地反映出實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠腸道細(xì)菌組成的差異與相同之處。本實(shí)驗(yàn)中灌胃抗生素后（泳道2）的B、I條帶是特有條帶；植物乳桿菌治療組泳道A、D、G條帶，是灌胃植物乳桿菌后特有條帶。條帶L存在于各組的樣品中，為共有條帶，說(shuō)明這個(gè)條帶所代表的細(xì)菌，可能對(duì)頭孢地尼具有一定的耐藥性。從DGGE圖譜整體可見(jiàn)，隨著植物乳桿菌灌胃時(shí)間的延長(zhǎng)，條帶數(shù)目逐漸增多，說(shuō)明腸道菌群的多樣性增加。在植物乳桿菌處理第4d腸道菌群結(jié)構(gòu)與正常小鼠基本一致。雖然灌胃植物乳桿菌可以使腸道菌群有所恢復(fù)，但與正常組小鼠的腸道菌群相比有些菌仍然無(wú)法恢復(fù)，如條帶K。泳道2中的條帶B是抗生素組中的優(yōu)勢(shì)條帶，其在灌胃益生菌初期存在，至灌胃第3d消失，該條帶所對(duì)應(yīng)的菌有可能是對(duì)腸道不利的菌，隨著灌胃時(shí)間延長(zhǎng)，植物乳桿菌對(duì)該菌有抑制作用。由此可見(jiàn)，DGGE指紋圖譜帶型的差異，能很好地反映出抗生素與植物乳桿菌對(duì)小鼠腸道菌群的不同影響。

平均數(shù)進(jìn)行非權(quán)重配對(duì)法（UPGMA）相似性聚類結(jié)果如圖2所示，更進(jìn)一步證明了植物乳桿菌作用過(guò)程中DGGE圖譜的異同。結(jié)果顯示，灌胃植物乳桿菌過(guò)程第2d與第3d相似性系數(shù)77%；第4d與第5d相似性為86%；灌胃植物乳桿菌過(guò)程中各泳道聚為一族，與正常小鼠相比相似性為60%。

植物乳桿菌對(duì)腸道微生物菌群多樣性的分析見(jiàn)表2。頭孢地尼處理后條帶數(shù)明顯減少，即腸道菌群種類減少，經(jīng)結(jié)合細(xì)菌數(shù)量的多樣性指數(shù)分析，菌群多樣性減少。植物乳桿菌治療組與抗生素處理組相比，條帶數(shù)有所增加，但與小鼠灌胃前比較，條帶數(shù)和菌群多樣性仍存在差異，但考慮細(xì)菌數(shù)量的多樣性指數(shù)與灌胃前無(wú)顯著性差異，說(shuō)明植物乳桿菌可以有效調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂。

2.3 DGGE圖譜對(duì)應(yīng)的腸道優(yōu)勢(shì)條帶DNA序列分析

表2 V3區(qū)引物DGGE圖譜的多樣性指數(shù)分析Table 2 Diversity indices analysis of the DGGE patterns generated from V3 regions

表3 DGGE代表?xiàng)l帶序列比對(duì)結(jié)果Table 3 Tentative identification of DGGE bands by sequencing the excised and Blast analysis

經(jīng)測(cè)序后，用Blast工具與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如表3所示。糞便中的細(xì)菌與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知細(xì)菌序列有很高的相似性，都在99%以上。L條帶在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一直存在，說(shuō)明該條帶所對(duì)應(yīng)的菌對(duì)頭孢地尼有耐藥性，而與L條帶同源性最高的是Clostridium clostridioforme（艱難梭菌）是梭菌屬的一種專性厭氧菌，一般寄生在人的腸道內(nèi)。艱難梭菌的菌群生長(zhǎng)速度加快，影響腸道中其他細(xì)菌，引發(fā)炎癥。圖1中可以看出，在灌胃植物乳桿菌過(guò)程中，A條帶亮度是逐漸降低的，說(shuō)明艱難梭菌隨著灌胃植物乳桿菌時(shí)間的延長(zhǎng)其在腸道中的數(shù)量逐漸減少。

I條帶是灌胃抗生素后特有的條帶，與I條帶同源性最高的是Pseudomonas stutzeri（施氏假單胞菌），假單胞菌一般能天然抵抗多種抗菌藥物，并且本菌在使用抗菌藥物治療過(guò)程中易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性。因此，該菌在灌胃大量抗生素后仍然存在腸道中。

C、M條帶是在灌胃植物乳桿菌過(guò)程中一直存在的條帶，說(shuō)明這兩個(gè)條帶對(duì)應(yīng)的細(xì)菌較容易恢復(fù)。與C條帶同源性最高的是Bacteroides stercoris（糞便擬桿菌），糞便菌群中的Bacteroides stercoris和結(jié)腸癌的高發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有顯著相關(guān)性。由此可知該菌在腸道菌群中占有重要地位。與M條帶同源性最高的是Ruminococcus gauvreauii strain，該菌群為專性厭氧菌，是腸道中優(yōu)勢(shì)菌群。楊會(huì)玲等[15]研究合生素對(duì)肉仔雞腸道微生物區(qū)系的影響中也檢測(cè)到了Ruminococcus gauvreauii strain。

D條帶是在灌胃植物乳桿菌前兩天很明顯，隨后條帶亮度逐漸減弱。條帶D與Bacteroides acidifaciens strain相似性為100%，該菌代表生酸擬桿菌，李永洙[16]研究顯示不良雞群樣本中均檢測(cè)到Bacteroides屬的生酸擬桿菌（Bacteroides acidifaciens），該菌對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育不利。由此可見(jiàn)，植物乳桿菌對(duì)腸道菌群有很好的調(diào)節(jié)作用，抑制有害菌的生長(zhǎng)。

F條帶是在灌胃植物乳桿菌后亮度逐漸增加的條帶，與F條帶同源性最高的是Bacteroides uniformis strain（單形擬桿菌），Queipo-Ortu?o MI等[17]研究紅酒多酚對(duì)人類腸道菌群的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)連續(xù)四周每天攝入紅酒多酚后，Bacteroides uniformis strain數(shù)量明顯增加。

G條帶是正常小鼠沒(méi)有而灌胃植物乳桿菌的小鼠出現(xiàn)的特有條帶，說(shuō)明該菌在腸道中較難恢復(fù)；與G條帶同源性最高的是Bacteroides graminisolvens strain。K條帶在灌胃結(jié)束后仍然無(wú)法恢復(fù)的特征條帶，與K條帶同源性最高的Bacteroides caccae strain（糞擬桿菌）。

3 結(jié)論

本文采用16S rDNA PCR-DGGE基因指紋分析技術(shù)，針對(duì)抗生素處理和植物乳桿菌治療過(guò)程中腸道菌群組成變化進(jìn)行初步分析，探討植物乳桿菌對(duì)抗生素誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群失調(diào)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：大劑量頭孢地尼處理會(huì)導(dǎo)致小鼠腸道菌群發(fā)生紊亂，對(duì)頭孢地尼敏感的可培養(yǎng)厭氧總菌、乳桿菌、雙歧桿菌、腸球菌及腸桿菌數(shù)量下降99%以上，多樣性和定植抗力嚴(yán)重受損，說(shuō)明本研究腸道菌群失調(diào)動(dòng)物模型制備是有效的。而DGGE圖譜顯示，Mycoplasma sualvi strain、Clostridium proteolyticum strain兩株菌在抗生素處理結(jié)束后演替為優(yōu)勢(shì)菌群，說(shuō)明這兩株菌是抗生素頭孢地尼的耐受菌及抗生素相關(guān)性菌群失調(diào)所導(dǎo)致臨床癥狀的致病菌。

隨著植物乳桿菌飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠腸道菌群豐富度呈現(xiàn)逐漸增加的演替過(guò)程，至飼喂第4d腸道菌群多樣性與正常小鼠基本一致。對(duì)圖譜上獨(dú)有的和各組共有的條帶進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明植物乳桿菌調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群失調(diào)的作用主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：選擇性地增加有益菌如Bacteroides stercoris、Bacteroides uniformis strain等的量；抑制致病菌如Clostridium clostridioforme、Pseudomonas stutzeri等的生長(zhǎng)。本研究為深入益生菌產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)以及進(jìn)一步探討益生菌對(duì)腸道菌群的作用機(jī)制的研究提供了參考。

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