斑玉蕈多糖的酶輔助提取及其抗氧化活性分析

鄭 義，邵 穎，陳安徽，朱園園，張娜娜

（1.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇徐州221000；2.江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221000）

斑玉蕈（Hypsizigus marmorens），隸屬擔(dān)子菌亞門(mén)、層菌綱、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬，是一種珍稀藥食兼用菌。斑玉蕈提取物對(duì)S180腫瘤、MethA纖維肉瘤、Lewis肺癌、HepG2等腫瘤均有明顯的抑制作用[1-4]，還具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血脂等作用[5-6]。多糖是真菌的主要活性成分之一，目前已經(jīng)上市的真菌多糖類保健品有上百種，在臨床上正式應(yīng)用的有香菇多糖、云芝多糖和裂褶菌多糖等多種，而未見(jiàn)有以斑玉覃多糖為主要成分的藥品及保健品。目前有關(guān)斑玉覃多糖的提取主要以熱水（或堿液）浸提法為主[7-8]，存在費(fèi)時(shí)、耗能高、多糖活性損失較大等問(wèn)題。酶輔助提取是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，酶處理可以提高多糖的得率，同時(shí)保持多糖的構(gòu)象與生物活性[9]，目前尚未見(jiàn)應(yīng)用于斑玉覃多糖提取的報(bào)道。多糖提取率受到酶解溫度、pH、酶添加量等多種因素的影響，需要對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)采用酶輔助提取斑玉覃多糖，對(duì)提取工藝及抗氧化活性進(jìn)行研究，旨在為開(kāi)發(fā)以斑玉覃多糖為主要成分的中藥及保健品提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

斑玉蕈子實(shí)體 江蘇徐州市售；木瓜蛋白酶（酶活≥100000U/g）、纖維素酶（酶活≥11000U/g）均為食品級(jí)，購(gòu)自江蘇無(wú)錫；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）Sigma公司；其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；THZ-82型恒溫振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司；標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩 浙江上虞華美儀器紗篩廠；風(fēng)選中藥粉碎機(jī) 山東省青州市精誠(chéng)機(jī)械制造有限公司；FA2104N型電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SENCO R201L型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；TGL-20M型高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶法提取斑玉蕈多糖 將新鮮斑玉蕈用清水洗凈，除去其根部，適當(dāng)切段于60℃干燥箱干燥，待斑玉蕈恒重，放入粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)60目篩，干燥保存待用。準(zhǔn)確稱取2g斑玉蕈干粉，溶于一定體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，預(yù)熱至酶解溫度，加入一定量的復(fù)合酶（木瓜蛋白酶和纖維素酶按1∶1質(zhì)量比例配合），恒溫振蕩器中提取一定時(shí)間。提取結(jié)束后沸水浴滅酶10min，冷卻，減壓抽濾，濾液濃縮后在4℃下用70%乙醇沉析12h、離心，所得沉淀用無(wú)水乙醇洗滌3次，冷凍干燥后得斑玉蕈多糖。

1.2.2 多糖含量測(cè)定 多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法[10]。

多糖得率（%）=斑玉蕈多糖質(zhì)量/斑玉蕈干粉質(zhì)量×100。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 考察復(fù)合酶添加量（復(fù)合酶質(zhì)量占斑玉蕈粉質(zhì)量的百分比）、pH、酶解溫度、提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.2.4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采取Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排四因素三水平實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素水平表如表1所示。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 DPPH自由基清除率測(cè)定 DPPH自由基清除率測(cè)定參考Wu[11]的方法，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5.2 還原力測(cè)定 還原力測(cè)定采用鐵氰化鉀法，參考Oyaizu[12]的方法，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5.3 羥基自由基清除率測(cè)定 羥基自由基清除率測(cè)定采用鄰二氮菲比色法[13]，重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 復(fù)合酶添加量對(duì)多糖得率的影響 固定pH5.0，酶解溫度50℃，提取時(shí)間2h，考察不同復(fù)合酶添加量對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，多糖得率隨酶添加量增加而遞增，復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.8%后，提取增加率趨于平緩，這是因?yàn)榻狍w系中復(fù)合酶已接近飽和狀態(tài)，致使多糖得率增長(zhǎng)平緩?？紤]酶的成本，宜將復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定為0.8%左右。

圖1 復(fù)合酶添加量對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of complex enzyme amount on the yield of polysaccharides

2.1.2 pH對(duì)多糖得率的影響 固定復(fù)合酶添加量0.8%，酶解溫度50℃，提取時(shí)間2h，考察不同pH對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。多糖得率隨著pH的升高，先急劇增加后減少，這表明復(fù)合酶催化水解斑玉蕈細(xì)胞壁較適宜的pH范圍為5.0～6.0，低于或高于適宜pH時(shí)，酶的活性降低，從而導(dǎo)致多糖得率降低。在pH5.5附近時(shí)，多糖得率相對(duì)較高，故選擇較優(yōu)pH為5.5。

圖2 pH對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis pH value on the yield of polysaccharides

圖3 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on the yield of polysaccharides

2.1.3 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響 固定復(fù)合酶添加量0.8%，pH5.0，提取時(shí)間2h，考察不同酶解溫度對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，多糖得率在40～55℃呈顯著增加的趨勢(shì)，這是因?yàn)闇囟仍礁?，浸提體系溶液的粘度越低，有助于胞內(nèi)多糖分子向外擴(kuò)散。但溫度大于55℃后，酶活受到抑制，多糖得率急劇下降，故選擇55℃為酶解溫度較優(yōu)值。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 固定復(fù)合酶添加量0.8%，pH5.0，酶解溫度50℃，考察不同提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。多糖得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，提取時(shí)間在1.0～2.5h之間，多糖得率顯著增加，當(dāng)時(shí)間超過(guò)2.5h后，提取增加率趨于平緩，表明大部分斑玉蕈多糖都已浸出，考慮到能耗，故選較優(yōu)提取時(shí)間為2.5h。

圖4 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides

2.2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表2所示。

2.2.1 回歸模型的建立與檢驗(yàn) 對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用多元回歸擬合后，得到多糖得率（Y）與復(fù)合酶添加量（x1）、酶解pH（x2）、酶解溫度（x3）和提取時(shí)間（x4）的回歸方程：

對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

該模型達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），決定系數(shù)R2為0.9566，校正決定系數(shù)R2Adj為0.9132，信噪比RSN為14.92，可知該回歸方程擬合度和可信度均很高，故可用于設(shè)計(jì)范圍內(nèi)的預(yù)測(cè)。各因素對(duì)斑玉蕈多糖得率的影響大小為：復(fù)合酶添加量＞提取時(shí)間＞酶解pH＞酶解溫度。

對(duì)表3回歸模型系數(shù)的顯著性分析可見(jiàn)，一次項(xiàng)中，x1、x4極顯著（p＜0.01），x2、x3達(dá)到顯著水平（p＜0.05）；平方項(xiàng)的回歸系數(shù)均極顯著，說(shuō)明各因素與多糖得率之間存在明顯的二次關(guān)系；二次項(xiàng)中僅有x1x4的回歸系數(shù)均達(dá)到顯著水平，表明復(fù)合酶添加量與提取時(shí)間之間的交互作用對(duì)斑玉蕈多糖的得率有顯著影響。如將不顯著項(xiàng)全部剔除，會(huì)導(dǎo)致回歸模型發(fā)生改變[14]，故保留p＜0.25的各項(xiàng)，簡(jiǎn)化后的回歸方程為式（2）：

2.2.2 兩因素間的交互效應(yīng)分析 由表3可知，僅復(fù)合酶添加量與提取時(shí)間的交互作用對(duì)斑玉蕈多糖的得率有顯著影響，固定酶解溫度和pH于零水平，繪出符合酶添加量與提取時(shí)間的交互效應(yīng)的響應(yīng)面，如圖5所示。多糖得率隨復(fù)合酶添加量和提取時(shí)間的變化會(huì)產(chǎn)生較大變化。當(dāng)復(fù)合酶添加量處于較低水平（＜0.8%）時(shí)，多糖得率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)先明顯增加后又呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)；當(dāng)復(fù)合酶添加量處于較高水平（＞0.8%）時(shí)，多糖得率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸提高，而當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)2.8h后，多糖得率趨于緩慢下降。若要獲得較高的多糖得率，復(fù)合酶添加量應(yīng)該在0.8%～1.0%之間，提取時(shí)間應(yīng)該在2.5～3.0h之間。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance with regression model

圖5 復(fù)合酶添加量與提取時(shí)間的交互效應(yīng)對(duì)多糖得率的影響Fig.5 Interactive effect of complex enzyme amount and extraction time on the yield of polysaccharides

2.2.3 最佳條件優(yōu)化及驗(yàn)證結(jié)果 通過(guò)所得回歸模型對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件為：復(fù)合酶添加量0.9%、酶解pH5.4、酶解溫度55.6℃、提取時(shí)間2.8h，在此條件下多糖得率的最大理論值為4.68%。對(duì)此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)3次，實(shí)測(cè)平均得率為4.70%；對(duì)該工藝進(jìn)一步放大，取200g斑玉蕈干粉提取多糖，實(shí)測(cè)得率為4.72%，與預(yù)測(cè)值基本一致，表明該回歸模型具有較好的預(yù)測(cè)性能，可用于指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。

2.3 斑玉蕈多糖的抗氧化活性

圖6 斑玉蕈多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effects of polysaccharides from Hypsizigus marmoreus against DPPH radicals

2.3.1 清除DPPH自由基的能力 DPPH法是評(píng)價(jià)抗氧化活性的常用方法，抗氧化物質(zhì)可直接作用于DPPH自由基，使其顏色變淺，根據(jù)吸光度的變化可測(cè)定物質(zhì)的抗氧化活性。由圖6可知，在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍，斑玉蕈多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增大而增大，且呈良好的線性正相關(guān)，線性方程為：y=4.2263+0.5831x，R2=0.9823。以半數(shù)效應(yīng)濃度（IC50值），即清除率為50%時(shí)的樣品質(zhì)量濃度，作為評(píng)價(jià)抗氧化能力的指標(biāo)，由線性方程得斑玉蕈多糖清除DPPH自由基的IC50值為78.5μg/mL。

2.3.2 還原力 抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性與其還原力存在著直接的聯(lián)系，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。鐵氰化鉀法測(cè)定原理為：亞鐵氰化鉀被樣品還原為鐵氰化鉀，鐵氰化鉀與Fe3+形成普魯士藍(lán)，在700nm處有最大吸收峰，吸光度越大，則樣品的還原力越強(qiáng)。在50～250μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，斑玉蕈多糖的還原力隨著濃度的增加而增加，當(dāng)濃度為250μg/mL時(shí)，吸光度最大為0.382±0.01。

圖7 斑玉蕈多糖的還原力Fig.7 Reducing power of polysaccharides from Hypsizigus marmoreus

2.3.3 清除羥基自由基的能力 羥基自由基是已知活性最強(qiáng)的活性氧自由基，可奪取蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的氧原子，引起機(jī)體損傷，清除羥基自由基可能是生物體抵御疾病的最有效方式之一。斑玉蕈多糖對(duì)羥基自由基的清除作用如圖8所示，在50～250μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，斑玉蕈多糖對(duì)羥基自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增大而增大，且呈線性正相關(guān)，線性方程為：y=-8.4173+0.3427x，R2=0.9802，IC50值為170.5μg/mL。

圖8 斑玉蕈多糖對(duì)羥基自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effects of polysaccharides from Hypsizigus marmoreus against hydroxyl radicals

3 結(jié)論

本研究建立了酶輔助提取斑玉蕈多糖的最佳工藝條件，即復(fù)合酶（木瓜蛋白酶和纖維素酶按1∶1質(zhì)量比例配合）添加量0.9%、酶解pH5.4、酶解溫度55.6℃、提取時(shí)間2.8h，在此條件下多糖得率的最大理論值為4.68%。對(duì)此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)3次，實(shí)測(cè)平均得率為4.70%，從實(shí)測(cè)多糖得率看，酶輔助提取優(yōu)于傳統(tǒng)的熱水浸提法，比熱水浸提得率3.38%（由本實(shí)驗(yàn)室測(cè)得）高1.32%。

斑玉蕈多糖具有較好的抗氧化活性，在一定范圍內(nèi)，其抗氧化能力與多糖質(zhì)量濃度呈線性正相關(guān)，清除DPPH和羥基自由基的IC50值分別為78.5μg/mL和170.5μg/mL。

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