益生乳桿菌質(zhì)?？股乜剐曰蚺c其耐藥性的相關(guān)性探討

韓俊華，李珊珊，裴家偉，陳大歡，張柏林

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001）

益生菌廣泛應(yīng)用于保健食品、藥品、乳制品、飼料等各個(gè)行業(yè)，與人們的日常生活關(guān)系越來(lái)越密切。FAO/WHO在《用于食品的益生菌安全性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則》中指出，未經(jīng)評(píng)估的益生菌可能會(huì)存在一些潛在的安全性問(wèn)題，其中，長(zhǎng)期使用的益生菌所攜帶耐藥基因的轉(zhuǎn)移是人們所擔(dān)憂的[1]。目前，抗生素濫用已成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題，由此引發(fā)的細(xì)菌耐藥性問(wèn)題也日趨嚴(yán)峻。盡管傳統(tǒng)的益生菌菌種已有很長(zhǎng)的安全使用歷史，如德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgricus），然而伴隨著新菌種的不斷開發(fā)和進(jìn)入市場(chǎng)，其潛在的安全性問(wèn)題也逐漸引起人們的重視。近十年來(lái)，有關(guān)乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌的耐藥性方面已經(jīng)開展了一定的研究工作。研究發(fā)現(xiàn)，大部分乳酸菌對(duì)抗革蘭陰性菌的抗菌藥具有耐藥性，例如鏈霉素、慶大霉素和卡那霉素，其中部分乳桿菌對(duì)萬(wàn)古霉素、卡那霉素、多黏菌素B等表現(xiàn)出抗藥性[2-4]。D’aimmo等報(bào)道了雙歧桿菌、乳桿菌、片球菌等對(duì)卡那霉素、萘啶酮酸、多粘菌素B等的抗性以及與抗性有關(guān)的基因，如長(zhǎng)雙歧（Bifidobacterium longum）抗四環(huán)素的基因tet（W），干酪乳桿菌（L.casei）抗四環(huán)素和紅霉素的質(zhì)粒基因tet（M）和erm（B）等[5]。Toomey等和ANA等則進(jìn)一步報(bào)道了抗四環(huán)素基因tet（M）在菌株間的轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[6-8]。顯然，這種抗藥基因在菌種間的轉(zhuǎn)移會(huì)對(duì)人類的健康產(chǎn)生影響。食品是益生菌的主要載體，益生菌的安全性勢(shì)必影響到其食品的安全，因此其耐藥性以及抗生素抗性是否可轉(zhuǎn)移就會(huì)引起人們的重視。本研究對(duì)前期篩選到的幾株能夠耐受胃酸、膽鹽和蛋白酶的乳桿菌的耐藥性進(jìn)行了研究，通過(guò)質(zhì)粒消除探討了耐藥性與質(zhì)粒的相關(guān)性，對(duì)進(jìn)一步確定耐藥性的轉(zhuǎn)移提供了理論基礎(chǔ)，旨在為潛在益生乳桿菌的安全性評(píng)價(jià)及其評(píng)價(jià)方法的建立提供理論和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5株耐受胃酸、膽鹽和蛋白酶且含有質(zhì)粒的乳桿菌 其菌種編號(hào)、名稱及來(lái)源見表1，該菌種均由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC）收藏；抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控菌株 采用CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute，臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所，簡(jiǎn)稱CLSI，以前稱NCCLS）推薦的大腸桿菌ATCC25922，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；乳桿菌采用MRS培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)；大腸桿菌ATCC25922采用LB培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)；氨芐西林10μg/片、桿菌肽0.04U/片、青霉素G 10U/片、多粘菌素B 300μg/片、利福平5μg/片、頭孢噻吩30μg/片、鏈霉素10μg/片、卡那霉素30μg/片、四環(huán)素30μg/片、氯霉素30μg/片、慶大霉素10μg/片、萘啶酸30μg/片、萬(wàn)古霉素 30μg/片（直徑6mm）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，符合CLSI標(biāo)準(zhǔn)；SDS、EB、氯霉素、氨芐青霉素 美國(guó)Sigma公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR Mix、100bp Ladder Marker 北京天根試劑公司；λHindⅢ Marker、HB101 上海寶生物公司；溶菌酶 Biotech公司。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株Table 1 Strains for experiment

GL-20G-II型冷凍離心機(jī)、TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；XSZ-G型光電顯微鏡 重慶光學(xué)儀器廠；SPX-150B型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；BTS-20M型凝膠成像系統(tǒng)、TGradient Thermocycler 96型PCR儀 德國(guó)Biometra公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 K-B法檢測(cè)乳桿菌的耐藥性 參考管遠(yuǎn)志等[9]的方法。待測(cè)菌在MRS培養(yǎng)基（蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，檸檬酸氫二銨2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐溫80 1.0mL/L，乙酸鈉5.0g/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，硫酸鎂0.58g/L，硫酸錳0.25g/L，pH6.2±0.2）中，37℃培養(yǎng)16h后，以無(wú)菌生理鹽水稀釋至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度（菌體濃度約為5×108CFU/mL）。取該菌液1mL入滅菌平皿中，將融化的MH固體培養(yǎng)基（牛肉膏6.25g/L；酪蛋白胨17.5g/L；可溶性淀粉1.5g/L；瓊脂1.3%；pH7.2±0.2，）約20mL倒入平皿，混勻。待培養(yǎng)基凝固后，室溫放置3～5min，用鑷子將藥敏紙片貼放在平皿上，輕壓使緊貼瓊脂表面，靜置5min，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，恒溫培養(yǎng)16～18h。量取抑菌圈直徑，并記錄結(jié)果。以標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株大腸桿菌ATCC25922為質(zhì)控菌，操作同上。受試菌株對(duì)多種抗生素的敏感性參照國(guó)際現(xiàn)行的臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)CLSI制定的《抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》第十九版信息增刊提供的紙片法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定（見表2）[10]。報(bào)告該受試菌對(duì)該抗生素是敏感（susceptible，S）、耐藥（resistant，R）、還是中介（intermediate，I）。

表2 K-B法藥敏實(shí)驗(yàn)紙片含藥量和判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Antibiotic susceptibility testing paper concentration and interpretation standards of K-B method

1.2.2 質(zhì)粒提取及檢測(cè) 取培養(yǎng)過(guò)夜的菌液10mL于離心管中，10000r/min離心5min，棄去上清，向沉淀中加入10mg/mL溶菌酶（以pH8.0，10mmol/L的Tris-HCl配制）500μL，搖勻，37℃水浴45min。采用質(zhì)粒提取試劑盒，對(duì)待測(cè)菌株質(zhì)粒進(jìn)行提取，并進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，以λHindⅢ為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker。

1.2.3 質(zhì)粒消除

1.2.3.1 SDS法 將待測(cè)菌株以2%的接種量接至含有不同濃度SDS的滅菌MRS培養(yǎng)基中（SDS濃度分別為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%）[11]，37℃恒溫培養(yǎng)12代，每代24h，以質(zhì)粒消除前菌株為對(duì)照，分別進(jìn)行質(zhì)粒提取，并對(duì)消除后的菌株進(jìn)行抗生素敏感性檢測(cè)。

表3 抗性基因的引物序列Table 3 The primer sequences of resistance genes

1.2.3.2 SDS-高溫法 將待測(cè)菌株以2%的接種量接至含有不同濃度SDS的滅菌MRS培養(yǎng)基中（SDS濃度分別為0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%），37℃恒溫培養(yǎng)24h，再以2%的接種量轉(zhuǎn)入滅菌MRS培養(yǎng)基中，42℃恒溫培養(yǎng)24h，此為一個(gè)循環(huán)[12]，重復(fù)2～3次，以質(zhì)粒消除前菌株為對(duì)照，分別進(jìn)行質(zhì)粒提取，并對(duì)消除后的菌株進(jìn)行抗生素敏感性檢測(cè)。

1.2.4 抗性基因的檢測(cè) 在NCBI中查到質(zhì)粒上的β-內(nèi)酰胺類抗性基因blr、ECP-1569、nps-1，以及氯霉素抗性基因cmlA、cat、cmlA1，在Genbank中下載其全序列，設(shè)計(jì)引物，序列見表3，委托三博遠(yuǎn)志公司合成。

以待測(cè)菌株的質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，相應(yīng)溫度退火30s，72℃延伸1min，34次循環(huán)，72℃延伸10min。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳（80～120V，30min），觀察產(chǎn)物電泳帶及其位置，按照100bp Ladder Marker確定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。委托寶生物工程（大連）有限公司對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 待測(cè)菌株的抗生素敏感性

采用K-B藥敏紙片法檢測(cè)5株乳桿菌對(duì)13種抗生素的敏感性，記錄抗生素對(duì)供試菌株的抑菌圈直徑，結(jié)果見表4。

按照CLSI制定的《抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》提供的紙片法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，結(jié)果如表5所示。據(jù)表5可知，待測(cè)的5株乳桿菌對(duì)萬(wàn)古霉素、多粘菌素B、桿菌肽、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素以及萘啶酸具有普遍的抗性，耐藥率達(dá)100%，而主要對(duì)四環(huán)素敏感，其中，嗜酸乳桿菌LL對(duì)11種抗生素（除青霉素G、利福平外）表現(xiàn)出較普遍的抗性。

2.2 抗性菌株的質(zhì)粒提取

表4 抗生素對(duì)待測(cè)菌株的抑菌圈直徑（mm）Table 4 Inhibition zone diameter of antibiotics to the tested strains（mm）

注：表中抑菌圈直徑為7，則表示紙片周圍沒(méi)有出現(xiàn)透明圈。

表5 待測(cè)乳桿菌對(duì)13種抗生素的敏感性Table 5 Antibiotic susceptibility of 13 antibiotics to the tested Lactobacillus strains

采用質(zhì)粒提取試劑盒對(duì)待測(cè)乳桿菌的質(zhì)粒進(jìn)行提取，結(jié)果如圖1所示。

圖1 乳桿菌中的質(zhì)粒Fig.1 Plasmid in Lactobacillus strains

由圖1可見，戊糖乳桿菌CH8的電泳圖顯示有6條質(zhì)粒DNA條帶，其中一條大于23kb。戊糖乳桿菌Lp-A顯示有兩條質(zhì)粒DNA條帶，分別為10kb、5kb左右。嗜酸乳桿菌LL和植物乳桿菌L11分別顯示有2條和4條質(zhì)粒DNA條帶，均含有一條10kb左右的質(zhì)粒條帶。瑞士乳桿菌LLB的電泳圖僅顯示一條10kb左右的質(zhì)粒DNA條帶。乳酸菌中普遍存在著質(zhì)粒，至少25種乳桿菌具有固有質(zhì)粒，而且一種菌有多個(gè)質(zhì)粒，質(zhì)粒大小一般在1.9～84.8kb，絕大多數(shù)的質(zhì)粒小于20kb[13]。Gevers等（2003）對(duì)風(fēng)干香腸中的乳桿菌進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些乳桿菌均具有10kb左右的質(zhì)粒，且在這些質(zhì)粒上攜帶了四環(huán)素耐藥基因tetM[14]。

在細(xì)菌的傳代過(guò)程中，某些質(zhì)?？赡軙?huì)從細(xì)胞中消失，但大多數(shù)的質(zhì)粒是穩(wěn)定存在的。本研究也對(duì)傳代30代后上述乳桿菌菌株的質(zhì)粒進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果證明了其質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

2.3 質(zhì)粒消除

耐藥質(zhì)粒的存在是細(xì)菌耐藥性的一個(gè)主要原因，因此質(zhì)粒消除是耐藥性消除的一種重要方法。質(zhì)粒消除便于觀察比較消除前后菌體表型的變化，從而得出質(zhì)粒的遺傳功能，在對(duì)于質(zhì)粒所含基因的研究中具有重要意義。

2.3.1 SDS法消除質(zhì)粒

2.3.1.1 消除前后的質(zhì)粒變化 采用濃度為0.05%～0.25%的SDS分別處理供試菌株，在SDS濃度為0.15%、0.2%和0.25%時(shí)，上述菌株均不能存活；濃度為0.1%時(shí)戊糖乳桿菌Lp-A和植物乳桿菌L11不能存活。因此選擇SDS處理后存活的菌株進(jìn)行質(zhì)粒檢測(cè)，結(jié)果如圖2～圖6所示。

結(jié)果表明，SDS濃度為0.05%時(shí)，植物乳桿菌L11的四條質(zhì)粒（在1～10kb不等）被完全消除（見圖4，泳道2），戊糖乳桿菌CH8的質(zhì)粒沒(méi)有被消除。當(dāng)SDS濃度增加到0.1%時(shí)，戊糖乳桿菌CH8的6條質(zhì)粒丟失了5條，包括一條大于23kb的質(zhì)粒及2kb到10kb間大小不等的4條質(zhì)粒，一條15kb左右的質(zhì)粒沒(méi)有被消除（見圖2，泳道3）。而嗜酸乳桿菌LL（見圖3）、戊糖乳桿菌Lp-A（見圖6）和瑞士乳桿菌LLB（見圖5）的質(zhì)粒均未被消除。由此可見，用SDS消除乳桿菌質(zhì)粒的效果不顯著，與之前的相關(guān)報(bào)道不相符[15]。

圖2 SDS法消除戊糖乳桿菌CH8質(zhì)粒Fig.2 Plasmid eliminate results of L.pentosus CH8 by SDS method

圖3 SDS法消除嗜酸乳桿菌LL質(zhì)粒Fig.3 Plasmid eliminate results of L.acidophilus LL by SDS method

圖4 SDS法消除植物乳桿菌L11質(zhì)粒Fig.4 Plasmid eliminate results of L.plantarum L11 by SDS method

圖5 SDS法消除瑞士乳桿菌LLB質(zhì)粒Fig.5 Plasmid eliminate results of L.helveticus LLB by SDS method

圖6 SDS法消除戊糖乳桿菌Lp-A質(zhì)粒Fig.6 Plasmid eliminate results of L.pentosus Lp-A by SDS method

2.3.1.2 消除質(zhì)粒后菌株抗生素敏感性的變化 采用K-B藥敏紙片法檢測(cè)質(zhì)粒消除后的CH8和L11菌株對(duì)抗生素的敏感性，結(jié)果見表6。由表6可知，戊糖乳桿菌CH8質(zhì)粒消除前后，其抗生素敏感性發(fā)生了部分變化。質(zhì)粒消除前，CH8菌株對(duì)氯霉素和頭孢噻吩均表現(xiàn)出抗性，而消除后對(duì)這兩種抗生素均表現(xiàn)出敏感，對(duì)其他11種抗生素的敏感性沒(méi)有變化?？梢?，消除的質(zhì)粒上可能含有抗氯霉素和頭孢噻吩的抗性基因。而植物乳桿菌L11消除了全部質(zhì)粒后，與消除前相比，其抗生素敏感性沒(méi)有變化，這也初步表明，植物乳桿菌L11的質(zhì)粒上不含有所試抗生素的抗性基因，或者在質(zhì)粒和基因組上同時(shí)含有所試抗生素的抗性基因。

2.3.2 SDS-高溫法消除質(zhì)粒

2.3.2.1 消除前后的質(zhì)粒變化 采用濃度0.01%～0.03%的SDS分別處理供試菌株，并進(jìn)行高溫培養(yǎng)。在SDS濃度為0.01%、0.015%和0.02%時(shí)，上述乳桿菌均存活，但只有CH8的質(zhì)粒被部分消除，且消除效果并不隨濃度的增加而改變，濃度為0.025%、0.03%時(shí)，CH8和部分菌株不能存活，仍具有存活能力的菌株，其消除效果不隨SDS濃度的增加而改善。因此選擇SDS-高溫處理后存活菌株進(jìn)行質(zhì)粒檢測(cè)，結(jié)果如圖7～圖11所示。

結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌LL（見圖8）、戊糖乳桿菌Lp-A（見圖9）、瑞士乳桿菌LLB（見圖10）和植物乳桿菌L11（見圖11）在SDS-高溫處理后質(zhì)粒并沒(méi)有被消除，而戊糖乳桿菌CH8的6條質(zhì)粒中丟失了5條（見圖7，泳道1、2、3），被部分消除。

圖7 SDS-高溫法對(duì)消除戊糖乳桿菌CH8質(zhì)粒Fig.7 Plasmid eliminate results of L.pentosus CH8 by SDS-high temperature method

圖8 SDS-高溫法消除嗜酸乳桿菌LL質(zhì)粒Fig.8 Plasmid eliminate results of L.acidophilus LL by SDS-high temperature method

圖9 SDS-高溫法消除戊糖乳桿菌Lp-A質(zhì)粒Fig.9 Plasmid eliminate results of L.pentosus Lp-A by SDS-high temperature method

表6 質(zhì)粒消除后抗生素敏感性的變化Table 6 Antibiotic sensitivity of the tested strains after eliminated the plasmids

圖10 SDS-高溫法消除瑞士乳桿菌LLB質(zhì)粒Fig.10 Plasmid eliminate results of L.helveticus LLB by SDS-high temperature method

圖11 SDS-高溫法消除植物乳桿菌L11質(zhì)粒Fig.11 Plasmid eliminate results of L.plantarum L11 by SDS-high temperature method

2.3.2.2 消除質(zhì)粒后菌株抗生素敏感性的變化 采用K-B藥敏紙片法檢測(cè)質(zhì)粒消除后戊糖乳桿菌CH8對(duì)13種抗生素的敏感性，結(jié)果見表7。由表7可見，CH8菌株進(jìn)行質(zhì)粒消除后其抗生素敏感性發(fā)生了部分變化。質(zhì)粒消除前，CH8菌株對(duì)氯霉素和頭孢噻吩均表現(xiàn)出抗性，而質(zhì)粒消除后菌株對(duì)這兩種抗生素均表現(xiàn)出敏感，對(duì)其他11種抗生素的敏感性沒(méi)有變化。該結(jié)果表明，消除的質(zhì)粒上可能存在抗氯霉素和頭孢噻吩的抗性基因。

2.4 抗性基因的檢測(cè)

以戊糖乳桿菌CH8的質(zhì)粒為模板，以表3中相應(yīng)的序列為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖12所示。

由圖12可見，戊糖乳桿菌CH8的質(zhì)粒上存在β-內(nèi)酰胺類抗性基因blr，不含有其他抗性基因。對(duì)上述目的條帶進(jìn)行回收、測(cè)序，并經(jīng)DNAman aligment分析發(fā)現(xiàn)，該序列與目的序列僅在第43和64位點(diǎn)有兩個(gè)堿基的差異，很可能是由于菌株差異造成的。因此可以初步確定戊糖乳桿菌CH8的質(zhì)粒上含有blr基因，且該基因是決定其頭孢噻吩抗性的基因。將該戊糖乳桿菌CH8菌株的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。然而，要確定blr基因位于CH8菌株的哪些質(zhì)粒上還有待于進(jìn)一步研究。

圖12 戊糖乳桿菌CH8質(zhì)粒的PCR結(jié)果Fig.12 PCR result of L.pentosus CH8 plasmid

國(guó)內(nèi)外常用的藥敏檢測(cè)方法都是通過(guò)細(xì)菌的表型來(lái)判斷其耐藥性，且對(duì)于抗性基因的研究多集中于致病菌。如果能在菌株抗生素抗性的表型與基因型之間建立聯(lián)系，就可能對(duì)該表型對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行定位，從而從分子水平對(duì)細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行深入分析。

目前，我國(guó)還少見由益生菌感染動(dòng)物及人體的報(bào)道，也缺乏對(duì)其耐藥性及使用后的流行病學(xué)調(diào)查資料，對(duì)益生菌的安全性評(píng)價(jià)手段與國(guó)際水平還處在一定的差距。隨著越來(lái)越多的新菌種申報(bào)進(jìn)入國(guó)內(nèi)市場(chǎng)以，也附帶了不安全性的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本研究方法可以為乳制品市場(chǎng)常用益生菌菌種的安全性進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為建立適合國(guó)情的益生菌安全性評(píng)價(jià)體系提供技術(shù)依據(jù)。

3 結(jié)論

3.1 以大腸桿菌ATCC25922為質(zhì)控菌株，對(duì)5株潛在益生乳桿菌的抗生素敏感性研究表明，菌株均對(duì)萬(wàn)古霉素、多粘菌素B、桿菌肽、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素以及萘啶酸表現(xiàn)出普遍的抗性，耐藥率達(dá)100%。

3.2 無(wú)論采用SDS還是SDS-高溫法消除質(zhì)粒方法，僅對(duì)部分菌株中的某些質(zhì)粒有效，即不同菌株之間，對(duì)于不同的質(zhì)粒其消除方法的有效性存在著差異。

3.3 對(duì)消除質(zhì)粒后的戊糖乳桿菌CH8抗生素敏感性的分析表明，CH8菌株的質(zhì)粒上存在決定其頭孢噻吩抗性的基因blr，這在一定程度上反映出益生乳桿菌質(zhì)?？股乜剐曰蚺c其耐藥性間存在相關(guān)性。

表7 戊糖乳桿菌CH8質(zhì)粒消除后抗生素敏感性的變化Table 7 Antibiotic sensitivity of L.pentosus CH8 after eliminated the plasmids

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