結直腸腺癌組織中FLNa、VEGF表達與微淋巴管密度的關系及意義

馬紅獻，史建偉，張利眾，劉勤英，李 中

(1 淶源縣醫(yī)院，河北保定 074300;2河北大學附屬醫(yī)院;3 保定市第一醫(yī)院)

結直腸腺癌是常見的胃腸道惡性腫瘤，局部復發(fā)和遠處轉移是患者預后較差的重要原因，淋巴道是轉移的重要途徑。細絲蛋白A(Filamin A，F(xiàn)LNa)是肌動蛋白結合蛋白家族成員之一，我們的前期研究表明其與結直腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關［1］。本研究采用免疫組化法檢測了FLNa、血管內皮生長因子(VEGF)和淋巴管特異性標志物D2-40在結直腸腺癌組織及正常結直腸組織中的表達情況，以進一步探討 FLNa、VEGF的表達及微淋巴管密度(Lymphatic microvessel density，LMVD)與結直腸腺癌發(fā)生、發(fā)展的相關性。

1 材料與方法

1.1 標本收集 標本為河北大學附屬醫(yī)院2005年1月～2006年12月結直腸腺癌手術切除癌組織(標本均取自腫瘤中心處)及其相應癌旁正常結直腸組織(標本取于距腫瘤邊緣至少10 cm處)各46份。46例結直腸腺癌患者中男27例，女19例;年齡34～80歲，平均58歲。診斷均經病理證實，無其他部位原發(fā)腫瘤，術前無放、化療及免疫生物治療史。其中結腸腺癌17例、直腸腺癌29例，有淋巴結轉移33例、無淋巴結轉移13例，有肝轉移9例、無肝轉移37例，浸潤深度達漿膜30例、未達漿膜16例。

1.2 FLNa、VEGF和D2-40的檢測 ①免疫組化采用鏈霉親和素—生物素—過氧化物酶檢測步驟(免疫組化試劑盒及單克隆鼠抗人D2-40一抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司;單克隆兔抗人FLNa一抗購自Epitomics公司;單克隆鼠抗人VEGF一抗購自Santa Cruz公司):組織標本采用10%中性甲醛固定、石蠟包埋，切成4 μm厚切片，經脫蠟、水化，置入盛有枸櫞酸緩沖液的容器內，于微波爐內(95℃，15 min)修復抗原，3%過氧化氫孵育20 min，PBS溶液沖洗，使用免疫組化試劑盒中的血清封閉，滴加兔抗人 FLNa一抗(1∶150)、鼠抗人 VEGF一抗(1∶100)和鼠抗人 D2-40一抗(1∶100)，4 ℃冰箱內過夜;PBS溶液沖洗，滴加免疫組化試劑盒內生物素標記的相關二抗，置于室溫30 min;PBS溶液沖洗，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，置于室溫30 min，PBS溶液沖洗，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精染色、脫水，二甲苯透明，樹膠封片。人子宮組織染色作為FLNa蛋白的陽性對照，人乳腺癌組織染色作為VEGF蛋白的陽性對照，人扁桃體組織染色作為D2-40蛋白的陽性對照，PBS溶液代替一抗進行染色作為陰性對照。②FLNa、VEGF表達及LMVD計數(shù)判定:FLNa和VEGF的陽性表達定位于細胞質，在高倍鏡下選擇5個視野計數(shù)，每個高倍視野下計數(shù)200個細胞，陽性細胞≤10%為1分、11% ～50%為2分、51% ～75%為3分，≥76%為4分;細胞質無色為0分、黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。上述兩分值的乘積＞3分判為陽性，≤3分判為陰性。D2-40陽性表達定位于淋巴管內皮細胞的胞質和(或)胞膜，呈清晰棕黃色顆粒，用于標記并計數(shù)LMVD。LMVD計數(shù)采用Weidner等［2］的方法，先在40倍顯微鏡下觀察整張切片的血管分布，選擇脈管最密集的4個區(qū)域(熱點區(qū))，在200倍顯微鏡下觀察，其中著色的細胞叢或單個細胞計為1條微淋巴管，取其均值為該組織切片的LMVD。由2名臨床病理醫(yī)師分別獨立閱片，共同確定判定結果。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料比較用t檢驗、單因素方差分析，計數(shù)資料用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行相關檢驗，相關關系分析用Spearman相關分析法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結直腸腺癌組織及其癌旁正常組織中FLNa、VEGF的表達及LMVD 結直腸腺癌組織中FLNa陽性22例(47.83%)、VEGF 陽性41 例(89.13%)，癌旁正常組織中分別為 42例(91.30%)、15例(32.61%)，兩種組織中FLNa、VEGF陽性表達率比較均有顯著差異(P均=0.000);結直腸腺癌組織及其癌旁正常組織中的 LMVD分別為(17.32±2.12)、(4.36 ±1.21)條，P=0.001。

2.2 結直腸腺癌組織中FLNa、VEGF表達及LMVD與腫瘤臨床病理參數(shù)的關系 結直腸腺癌組織中FLNa、VEGF的表達及LMVD值與有無淋巴結轉移、肝轉移及癌灶的浸潤深度有關，而與年齡、性別及癌灶的部位無關，詳見表1。

2.3 結直腸腺癌組織中FLNa、VEGF表達及LMVD三者間的相關性 結直腸腺癌組織22例FLNa表達陽性者中，VEGF表達陽性18例、陰性4例;24例FLNa表達陰性者中，VEGF表達陽性23例、陰性1例，F(xiàn)LNa和VEGF的表達水平呈顯著負相關(r=-0.445，P=0.000)。FLNa 表達陽性和陰性者的 LMVD 分別為(3.24 ±0.57)、(16.23 ± 3.64)條，P=0.001;VEGF表達陽性和陰性者的LMVD分別為(15.65 ±1.26)、(2.94 ±0.61)條，P=0.000。

3 討論

腫瘤微淋巴管與腫瘤生長、局部浸潤及遠處轉移關系密切［3］。腫瘤細胞經淋巴管轉移的具體機制尚不完全明確，但研究表明腫瘤細胞發(fā)生淋巴道轉移時微淋巴管數(shù)量增多［4］。研究淋巴管內皮細胞的分子標志物包括VEGFR-3、Desmoplakin、LYVE-1、Podoplanin、D2-40、Prox-1 及 CD34等［5］。一項對比研究證實，D2-40對淋巴管內皮細胞具有較高的敏感性［6］。本研究中使用D2-40標記微淋巴管、檢測LMVD，結果證實結直腸腺癌組織中的LMVD顯著高于癌旁正常結直腸組織，并且與有無淋巴結轉移、肝轉移及癌灶的浸潤深度有關。

表1 結直腸腺癌組織中FLNa、VEGF的表達及LMVD與腫瘤臨床病理參數(shù)的關系

微淋巴管的形成及增殖受諸多因素的調節(jié)，多種血管生成促進因子可促進微淋巴管的生長，如VEGF、內皮素-1和堿性成纖維細胞生長因子等［7］。而內皮抑素、干擾素-α和血小板因子-4等可抑制淋巴管內皮細胞的增殖，促進其凋亡，從而抑制微淋巴管的生成［8］。對腫瘤微淋巴管生長進行抑制可有效阻遏腫瘤細胞經淋巴道擴散。FLNa是主要存在于細胞質的大分子蛋白，是細胞信號轉導的支架蛋白，影響多種重要受體在細胞內的功能發(fā)揮，參與多條與腫瘤形成相關的主要信號轉導通路，在腫瘤的形成及發(fā)展中具有重要作用［9］。VEGF是具有生物活性的糖蛋白，能促進血管內皮細胞的增殖、增強毛細血管的通透性，并誘導形成淋巴管［10］。Zhu等［11］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LNa與VEGF結合經泛素化后可使VEGF降解。本研究發(fā)現(xiàn)，結直腸腺癌組織中的FLNa陽性表達率顯著低于癌旁正常結直腸組織，而VEGF陽性表達率顯著高于癌旁正常結直腸組織，兩者均與腫瘤有無淋巴結轉移、肝轉移及癌灶的浸潤深度有關，均與患者年齡、性別無明顯相關;FLNa與VEGF在結直腸癌組織中的表達水平呈顯著負相關，F(xiàn)LNa表達陽性者的LMVD顯著低于FLNa表達陰性者，VEGF表達陽性者的LMVD顯著高于VEGF表達陰性者。提示FLNa、VEGF的表達水平和LMVD與結直腸腺癌的形成、發(fā)展密切相關，其機制可能為FLNa通過下調VEGF的表達水平抑制腫瘤微淋巴管生長，最終抑制腫瘤細胞經淋巴道擴散。

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