卵巢上皮性腫瘤組織中DNA-PKcs、Ku70蛋白的表達(dá)變化及意義

由衛(wèi)芝，申愛方，張 玲，趙新蕊

(聊城市人民醫(yī)院，山東聊城 252000)

卵巢原發(fā)性惡性腫瘤中以上皮性癌最常見，占60% ～90%［1］，有關(guān)其發(fā)病機(jī)理及發(fā)生、發(fā)展的基因?qū)W說眾多。DNA依賴蛋白激酶(DNA dependent protein kinase，DNA-PK)屬于磷脂酰肌醇-3蛋白激酶(PI3KK)家族，與基因穩(wěn)定性有較為密切的關(guān)系，DNA-PK的催化亞單位(DNA-PKcs)及調(diào)節(jié)亞單位(Ku70)共同參與DNA損傷修復(fù)途徑［2］，此兩個亞基異常表達(dá)均可能使生物體的基因組完整性和細(xì)胞穩(wěn)定性遭到破壞，引起細(xì)胞增殖和分化失控，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本研究通過免疫組化法檢測了DNAPKcs、Ku70蛋白在不同上皮性卵巢腫瘤組織中的表達(dá)情況，并分析了兩者在卵巢腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的意義?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 聊城市人民醫(yī)院有完整臨床和病理資料并行手術(shù)治療的上皮性卵巢癌石蠟包埋組織標(biāo)本共63份，組織標(biāo)本獲取時間為2008年1月～2011年12月。所有病例術(shù)前均根據(jù)診治方案并在患者知情同意下未行放、化療及激素治療，均經(jīng)病理檢查確診，患者年齡18～72歲。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟FIGO2000年臨床分期標(biāo)準(zhǔn)上皮性卵巢癌Ⅰ～Ⅱ期41例、Ⅲ～Ⅳ 期22例，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，并發(fā)腹水28例;組織分化程度為中高分化43例，低分化20例;組織病理類型為漿液性腺癌40例，黏液性腺癌23例。隨機(jī)選取同期良性上皮性卵巢腫瘤組織標(biāo)本20份作為對照。

1.2 DNA-PKcs、Ku70蛋白的檢測 組織石蠟切片厚度4 μm，常規(guī)脫蠟至水，采用高壓煮沸法行抗原修復(fù)后按SP試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司提供)說明書檢測DNA-PKcs、Ku70蛋白表達(dá) 。一抗試劑為DNA-PKcs兔抗人多克隆抗體、Ku70兔抗人多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供)，均按說明書要求配制，工作濃度1∶300，DAB顯色，蘇木素對比染色。以PBS緩沖液代替一抗做陰性對照，每批切片免疫組化染色分析均以已知陽性組織切片做陽性對照。染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):隨機(jī)選擇5個高倍視野，計數(shù)500個以上細(xì)胞，均以胞核著色判斷為陽性，對陽性細(xì)胞數(shù)及著色強(qiáng)度進(jìn)行半定量，其中陽性細(xì)胞數(shù)為0計0分、1% ～30%計1分、31% ～70%計2分、71% ～100%計3分，細(xì)胞著色強(qiáng)度按照不著色、淺棕色、棕黃色、棕褐色依次計0、1、2、3分，上述兩項評分之和0分為陰性、1～2分為弱陽性(+)、3～4分為中陽性(++)、5～6分為強(qiáng)陽性(+++)，陽性率按中陽性和強(qiáng)陽性計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包。率的比較用χ2檢驗，DNA-PKcs和Ku70蛋白表達(dá)的關(guān)系分析采用Spearman等級相關(guān)分析法。P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種不同上皮性卵巢腫瘤組織中DNA-PKcs、Ku70蛋白的表達(dá) 上皮性卵巢癌和良性上皮性卵巢腫瘤組織中DNA-PKcs蛋白的陽性表達(dá)率分別為68.25%(43/63)、15.00%(3/20)，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。上皮性卵巢癌和良性上皮性卵巢腫瘤組織中Ku70蛋白的陽性表達(dá)率分別為76.19%(48/63)、20.00%(4/20)，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.2 DNA-PKcs、Ku70蛋白的表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 DNA-PKcs蛋白表達(dá)與上皮性卵巢癌的病理學(xué)分級和手術(shù)病理分期相關(guān)(P＜0.05)，而與組織類型、腹水、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)(P＞0.05)。Ku70蛋白的表達(dá)與上皮性卵巢癌的手術(shù)病理分期、病理學(xué)分級、腹水及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均相關(guān)(P ＜0.05)，與組織病理學(xué)類型無關(guān)(P ＞0.05)。詳見表1。

表1 DNA-PKcs、Ku70蛋白的表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 上皮性卵巢癌組織中DNA-PKcs蛋白和Ku70蛋白表達(dá)的相關(guān)性 上皮性卵巢癌組織中DNAPKcs蛋白和Ku70蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.619，P＜0.001)，詳見表2。

表2 上皮性卵巢癌組織中DNA-PKcs蛋白和Ku70蛋白表達(dá)的相關(guān)性(例)

3 討論

目前，卵巢癌發(fā)病原因不清，諸多研究表明多種基因在其發(fā)生中起協(xié)同作用［3］，DNA-PK因在DNA損傷修復(fù)中具有關(guān)鍵作用，近年來受到越來越廣泛的關(guān)注。DNA-PK包括催化亞單位DNA-PKcs和結(jié)構(gòu)亞單位Ku70、Ku80組成的異二聚體全酶［4］。Ku異二聚體是DNA雙鏈斷裂(DNA doublestrand break，DSB)進(jìn)行非同源性末端連接(Nonhomologous end joining，NHEJ)修復(fù)時啟動階段必須的酶，而DNA-PKcs發(fā)揮催化酶的活性，二者結(jié)合共同參與DNA 損傷修復(fù)途徑［5，6］。DNA 損傷修復(fù)啟動修復(fù)機(jī)制，是一種抑制癌癥發(fā)生的有效保護(hù)途徑，能夠使細(xì)胞免于凋亡或死亡。例如，對哺乳動物腫瘤細(xì)胞DNA所致?lián)p傷進(jìn)行及時修復(fù)有助于腫瘤細(xì)胞免于死亡。研究表明，在惡性腫瘤中普遍存在DNA-PK表達(dá)變化，許多腫瘤細(xì)胞均可見DNA-PK復(fù)合物的高表達(dá)［7～9］。有研究認(rèn)為，卵巢癌組織中細(xì)胞的DNA修復(fù)能力增強(qiáng)，DNA-PKcs在卵巢良性腫瘤組織中的表達(dá)低于卵巢癌組織［10］。本實驗研究結(jié)果支持上述觀點(diǎn)，提示DNA-PKcs可能通過抑制癌細(xì)胞凋亡在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，此基因?qū)τ阼b別卵巢腫瘤的良惡性生物學(xué)行為有一定指導(dǎo)意義。為進(jìn)一步深入了解不同卵巢組織中的DNAPKcs表達(dá)水平，本研究用免疫組化的方法進(jìn)行檢測，并結(jié)合臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示DNAPKcs與上皮性卵巢癌的分化程度及臨床分期有關(guān)。提示DNA-PKcs的異常表達(dá)與腫瘤的惡性程度及進(jìn)展有一定關(guān)系，此與Hosoi等［11］的研究結(jié)果一致。Ku70最早發(fā)現(xiàn)于多發(fā)性肌炎綜合征患者自身抗原，是完成NHEJ途徑DNA-PK的重要因子之一。由于其功能的多樣性及復(fù)雜性，近年來與腫瘤的相關(guān)性研究逐漸引起關(guān)注。

Ku70的高表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，Ku70的表達(dá)水平在腫瘤及原發(fā)灶之間存在顯著差異，明顯強(qiáng)于正常組織，并與腫瘤的侵潤性、分期和轉(zhuǎn)移灶有關(guān)［12］。Economopoulou等［13］通過Western Blotting方法檢測了Ku70在成人骨髓異常增生綜合征組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)核型預(yù)后較好患者的Ku70表達(dá)率低;Mazzarelli等［14］發(fā)現(xiàn)，Ku70在正常直腸黏膜組織表達(dá)中較弱，在直腸癌組織中的表達(dá)顯著增強(qiáng)。本研究顯示，上皮性卵巢癌組織中Ku70蛋白的陽性表達(dá)率顯著高于良性上皮性卵巢腫瘤組織，且其表達(dá)與上皮性卵巢癌組織學(xué)類型無關(guān)，與臨床分期、病理學(xué)分級、腹水、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)，與諸多文獻(xiàn)報道相似。表明Ku70的表達(dá)與上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及惡性程度相關(guān)，此在婦科其他惡性腫瘤中也有論證。張妍等［15］的研究表明，Ku70的表達(dá)與宮頸癌組織分化程度相關(guān)，Ku70蛋白高表達(dá)者組織分化程度差、惡性程度高，此亦表明Ku70的過度表達(dá)在腫瘤的進(jìn)展過程中起一定作用。故檢測Ku70蛋白表達(dá)對于間接判斷腫瘤患者的治療效果及預(yù)后可能有重要指導(dǎo)意義，下調(diào)Ku70蛋白的表達(dá)水平將成為抗癌治療的新方向。本研究還顯示，DNA-PKcs、Ku70在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)?？赡軝C(jī)制:DNAPKcs與Ku70均為DNA-PK的重要亞基，二者在細(xì)胞DSB修復(fù)過程中發(fā)揮重要的協(xié)同作用。

綜上所述，DNA-PKcs、Ku70蛋白高表達(dá)可能在上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮協(xié)同作用，且有可能成為上皮性卵巢癌早期診斷、預(yù)后判斷的新指標(biāo)及治療靶點(diǎn)。

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