反膠團(tuán)萃取分離紅豆蛋白質(zhì)

楊秋慧子，張志寬，陳雨泰，曹 禮，2，張喜峰

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095;2.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000)

紅豆，又稱赤豆、小豆、赤小豆、飯豆，為一年生豆科植物，色澤鮮紅、淡紅或深紅。已有研究證明紅豆中含有蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、膳食纖維、B族維生素等營養(yǎng)物質(zhì)［1－3］。因此，紅豆具有較高營養(yǎng)價(jià)值。我國對紅豆蛋白質(zhì)開發(fā)利用有限，高效充分提取蛋白質(zhì)，促進(jìn)紅豆蛋白功能食品加工可持續(xù)發(fā)展，以期為紅豆蛋白利用開辟新的途徑。紅豆蛋白質(zhì)現(xiàn)有分離純化技術(shù)包括:堿溶酸沉法［4］、酶解法［5－6］、微波輔助提取法［7］。堿溶酸沉法易導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集。酶解法周期較長，在分離提取蛋白質(zhì)同時(shí)引入酶組分，增加分離純化難度。微波輔助提取法僅適用于熱穩(wěn)定性物質(zhì)的提取，對于熱敏性物質(zhì)，微波加熱可能使其變性或失活。微波萃取過程中細(xì)胞因受熱而破裂，一些不希望得到的組分也會溶解于溶劑中，從而使微波萃取的選擇性顯著降低。反膠團(tuán)萃取是近年來發(fā)展起來的一種新型萃取技術(shù)，主要適合于蛋白質(zhì)的提取和分離，具有操作簡單、處理量大、成本較低、前萃取和后萃取同時(shí)進(jìn)行的優(yōu)點(diǎn)［8］。且反膠束內(nèi)的環(huán)境接近細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境，蛋白質(zhì)不易變性［9］。本實(shí)驗(yàn)采用陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)反膠團(tuán)體系萃取紅豆中蛋白質(zhì)。采用Plackett－Burman(PB)實(shí)驗(yàn)綜合考察水相pH、表面活性劑濃度、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)濃度、有機(jī)溶劑與助劑種類和比例、萃取時(shí)間、萃取溫度對萃取率的影響，然后利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)及Box－Behnken設(shè)計(jì)選取對影響前萃取率的顯著因素進(jìn)行中心組合實(shí)驗(yàn)，獲取最佳前萃取條件，在該條件下進(jìn)行反萃取實(shí)驗(yàn)，為紅豆中蛋白質(zhì)的提取條件的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅豆 購于甘肅省張掖市甘州區(qū)新樂超市;正丁醇 天津市富宇精細(xì)化工有限公司;正辛醇 廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司;十六烷基三甲基溴化銨、正己醇 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;異辛烷、氯仿正辛烷 天津市百世化工有限公司;檸檬酸、磷酸氫二鈉、氯化鈉 天津開發(fā)區(qū)海光化學(xué)制藥廠;牛血清白蛋白 科昊生物工程有限責(zé)任公司。

PL203電子天平 梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;DKB－501數(shù)顯超級恒溫水浴鍋、DHG－9101.1電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司;752N型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;CR－21高速離心機(jī) 日本日立;漩渦混合器上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅豆中蛋白質(zhì)的提取 稱取5g紅豆粉末置于100mL磷酸二氫鈉－磷酸氫二鈉緩沖液中，在常溫下攪拌使之混勻，靜置30min，將得到的懸濁液于6000r/min離心10min，傾倒上清液可得到含紅豆蛋白質(zhì)的粗提液，測定水相中蛋白質(zhì)含量。

1.2.2 反膠團(tuán)溶液的配制［10］將CTAB以一定比例溶于有機(jī)溶劑(烷)和助劑(醇)的混合液中，充分搖勻至溶液透明為止。

1.2.3 反膠團(tuán)的前萃?。?1］在20mL試管中加入等體積的紅豆蛋白粗提液和反膠團(tuán)溶液(均為5mL)，在漩渦混合器上以60次/min的頻率振蕩試管5min使兩相充分混合，然后靜置至分相，測定水相中蛋白質(zhì)含量，計(jì)算萃取率。

1.2.4 反膠團(tuán)的反萃?。?2］用去離子水配制適當(dāng)pH和離子強(qiáng)度的緩沖液作為反萃取水相，與前萃取所得的有機(jī)相混合(均為5mL)，在漩渦混合器上以60次/min的頻率振蕩試管5min使兩相充分混合，然后靜置至分相。測定水相中蛋白質(zhì)含量，計(jì)算反萃取率。

1.2.5 紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量［13］用檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液將牛血清白蛋白(BSA)配成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL 不同梯度的溶液，以檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液為空白對照，在280nm波長下測吸光值，以吸光值為A280縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)(mg/mL)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。作線性回歸，得直線方程為:Y=0.5436X+0.0277(R2=0.991)

紅豆中蛋白質(zhì)的前萃取率E、反萃取率E'的計(jì)算如下式所示:

式中:C0為提取液中蛋白質(zhì)的濃度(mg/mL)，C1為前萃取平衡后水相中蛋白質(zhì)的濃度(mg/mL)，C2為反萃取后水相中蛋白質(zhì)的濃度(mg/mL)。

2 結(jié)果與討論

2.1 前萃取

2.1.1 有機(jī)溶劑與助劑種類對萃取的影響 實(shí)驗(yàn)在已確定陽離子表面活性劑CTAB的基礎(chǔ)上，考察不同種醇類、烷類有機(jī)溶劑作為反膠團(tuán)有機(jī)相與助劑體系對萃取的影響，結(jié)果如表1所示。從表1可知，不同的溶劑與助劑組合，在萃取過程中對分相時(shí)間和澄清度均有影響。

表1 溶劑與助劑體系對萃取的影響Table 1 Effect of the system of organic solvent and complex solubilizer on extraction yield of protein from red beans

大多數(shù)表面活性劑在脂肪族有機(jī)溶劑如己烷、庚烷、異辛烷等中的溶解性較差，難以形成穩(wěn)定的反膠束體系，不利于蛋白質(zhì)的萃取。助溶劑有助于表面活性劑分散在有機(jī)相中形成反膠團(tuán)，從而提高蛋白質(zhì)的萃取率。這是由于助溶劑分子插入到表面活性劑分子之間，減弱了表面活性劑的內(nèi)聚力和松懈了表面活性劑在有機(jī)相中的排列，則使大分子表面活性劑易溶于有機(jī)相形成反膠團(tuán)，利于蛋白質(zhì)的溶解。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)最終采用正丁醇－氯仿的反膠團(tuán)體系來考察其它主要因素對紅豆中蛋白質(zhì)萃取率影響。

2.1.2 Plackett－Burman設(shè)計(jì)篩選影響紅豆蛋白質(zhì)萃取率顯著因素 在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本次實(shí)驗(yàn)采用次數(shù)n=12的Plackett－Burman設(shè)計(jì)從7個(gè)影響因素中篩選出具有顯著影響因素。每個(gè)因素取2個(gè)水平:即高水平和低水平以盡快而有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2、表3所示。

表2 Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)因素水平范圍Table 2 Factors and levels in the Plackett－Burman design

對這7個(gè)因素的效應(yīng)分析結(jié)果見表4。一般認(rèn)為影響值較大的因素對系統(tǒng)的貢獻(xiàn)比較大，從表4可以看出，所考察的7個(gè)因素對紅豆蛋白質(zhì)提取率的影響順序依次為 X5＞X2＞X1＞X3＞X4＞X6＞X7。通過Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果可以看出 X5、X2、X1這三個(gè)因素為顯著因素，X3、X4、X6、X7對結(jié)果的影響不大，為非顯著因素。下一步通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近萃取條件的最佳區(qū)域。

表3 Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(n=12)Table 3 Plackett－Burman design matrix and corresponding results(n=12)

表4 Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)因素水平及其效應(yīng)評價(jià)Table 4 Levels and effects of six factors after Plackett－Burman design optimization

2.1.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果 響應(yīng)面擬合方程只有在考察的臨近區(qū)域里才能充分近似真實(shí)情況，所以應(yīng)先逼近最大萃取區(qū)域后再建立有效的擬合方程［14］。根據(jù) Plackett－Burman法找出顯著因素后，再進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，要先逼近最佳萃取區(qū)域后再建立有效地響應(yīng)面擬合方程。顯著因素萃取時(shí)間、水相pH、CTAB濃度的變化及方向的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表5，不顯著因素表現(xiàn)為正效應(yīng)的取高水平，表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)的取低水平［15］。

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Steepest ascent design and corresponding results

由以上結(jié)果可知，最大萃取率在6號實(shí)驗(yàn)附近，故選其做中心點(diǎn)，萃取時(shí)間為90min、水相pH為4.5、CTAB濃度為40mmol/L。

2.1.4 響應(yīng)面交互作用分析與顯著因素最佳值的確定 根據(jù)最陡爬坡確定的實(shí)驗(yàn)因素中心點(diǎn)，設(shè)計(jì)的響應(yīng)面因素及水平如表6所示，采用Box－Benhnken設(shè)計(jì)，其結(jié)果如表7所示。

表6 Box－Benhnken實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 6 Factors and levels in the Box－Benhnken experimental design

表7 Box－Benhnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 The experimental design and results for response surface analysis

運(yùn)用Design－Expert8.0.5.0軟件進(jìn)行二次回歸擬合后，得到以下回歸方程:

從表8方差分析可以看出，模型p＜0.01，表明該模型是顯著。同時(shí)模型中參數(shù)B、A2、B2、C2影響是極顯著的，其余項(xiàng)的影響不顯著。模型失擬項(xiàng)(lack of fit)的p＞0.05，不顯著，說明該模型不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)，模型選擇合適。同時(shí)，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9350，說明模型擬合程度很好。變異系數(shù)(C.V)反映模型的置信度，C.V值越低模型的置信度越高，本實(shí)驗(yàn)的C.V=3.49%，說明模型方程能夠很好地反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)值。所以，我們可以使用該模型來分析響應(yīng)值的變化。

通過Design－expert8.0.5.0軟件繪制了三維響應(yīng)面曲面圖，從響應(yīng)面立體圖可以看出，AB、AC、BC三個(gè)交互作用都不顯著。當(dāng)各因素從四周逐漸趨向中心點(diǎn)時(shí)，立體圖中的曲面越凸，則說明各因素的值越靠近中心點(diǎn)時(shí)，紅豆蛋白質(zhì)的萃取率越大，響應(yīng)值存在最大值。通過Design－Expert8.0.5.0軟件分析計(jì)算得出，當(dāng)預(yù)測的響應(yīng)值最大時(shí)，三個(gè)因素的最佳值為:萃取時(shí)間 90min、水相 pH4.3、CTAB濃度40.24mmol/L，預(yù)測提取率最大值為53.5956%。

表8 Box－Benhnken Design回歸模型方差分析Table 8 Analysis of variance of the fitted regression modle

2.1.5 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了驗(yàn)證建立的模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否相符，根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果確定的最佳條件:萃取時(shí)間 90min、水相 pH4.3、CTAB濃度40.24mmol/L，進(jìn)行了3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到的最大提取率為56.85%，這與預(yù)測值53.5956%相接近，證明擬合模型能較好的反映紅豆蛋白質(zhì)前萃取的最佳條件。

2.2 反萃取

在前萃取Plackett－Burman設(shè)計(jì)和中心組合法的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行反萃取實(shí)驗(yàn)，反萃取實(shí)驗(yàn)在前萃取的最優(yōu)條件(水相pH4.3、CTAB濃度40.24mmol/L、時(shí)間90min)下進(jìn)行。

2.2.1 反萃水相pH對紅豆蛋白反萃取率的影響配制不同 pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)緩沖溶液，與固定的有機(jī)相等體積混合(均為4mL)進(jìn)行反萃取，反萃時(shí)間90min，反萃溫度20℃，結(jié)果如圖2所示。

CTAB是一種陽離子表面活性劑，形成的反膠團(tuán)核內(nèi)帶正電，進(jìn)行反萃取時(shí)，要求蛋白質(zhì)帶正電荷，由于靜電斥力作用，反膠束的蛋白質(zhì)被反向萃取出來，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的反萃，所以水相pH應(yīng)小于紅豆蛋白質(zhì)pI=3.6。但pH過低會引起生物活性的喪失，從而導(dǎo)致反萃取率下降。如圖2所示，水相pH大于紅豆蛋白質(zhì)pI=3.6時(shí)，蛋白質(zhì)帶有負(fù)電荷，且反萃取率較高。此現(xiàn)象無法用靜電相互作用機(jī)理來闡釋，可能還存在其它相互作用，有待進(jìn)一步研究。因此綜上可知，反萃取的最佳pH為6。

2.2.2 NaCl濃度對反萃取率的影響 配制含不同NaCl濃度(0.8、0.9、1.0、1.1、1.2mol/L)pH 為 6 緩沖溶液，與固定的有機(jī)相等體積混合(均為4mL)進(jìn)行反萃取，反萃時(shí)間90min，反萃溫度20℃，結(jié)果如圖3所示。

圖1 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plot for the pairwise interactive effects of CTAB concentration，pH and extraction time on forward extraction yield

圖2 pH對紅豆中蛋白質(zhì)反萃取率的影響Fig.2 Effect of pH value in aqueous phase on back extraction yield of protein from red beans

圖3 NaCl濃度對紅豆中反萃取率的影響Fig.3 Effect of NaCl concentration on back extraction yield of protein from red beans

如圖3所示，反萃取率隨著NaCl濃度的增加而增加，但當(dāng)NaCl濃度增加到一定值后，蛋白質(zhì)的反萃取率逐漸降低。這是由于NaCl濃度增加時(shí)，表面活性劑周圍的雙電層厚度變薄，減小了表面活性劑極性頭之間的排斥作用使反膠團(tuán)變小，從而使蛋白質(zhì)在內(nèi)相的增溶量減小，反萃取率增加［12］。但是NaCl濃度過高對蛋白質(zhì)會產(chǎn)生鹽析作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的反萃取率降低。因此實(shí)驗(yàn)最終確定NaCl濃度為1.1mol/L。

2.2.3 反萃取溫度對反萃取率的影響 配制含NaCl濃度為1.1mol/L，pH為6的溶液，在不同溫度(20、25、30、35、40℃)下與固定的有機(jī)相等體積混合(均為4mL)進(jìn)行反萃取，反萃時(shí)間90min，結(jié)果如圖4所示。

圖4 反萃溫度對紅豆中蛋白質(zhì)反萃取率的影響Fig.4 Effect of temperature on back extraction yield of protein from red beans

由圖4可得，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)的反萃取率逐漸下降，之后有回升，但起始位于最高點(diǎn)。這是因?yàn)殡S著溫度的升高會影響反膠團(tuán)體系的行為，導(dǎo)致獨(dú)立水相析出，釋放出其中的蛋白質(zhì)，故反萃取率降低［16］。因此實(shí)驗(yàn)選定反萃取溫度為20℃。

在20℃，含NaCl濃度為1.1mol/L的pH為6.0緩沖溶液進(jìn)行蛋白質(zhì)反萃取，紅豆蛋白質(zhì)的反萃取率可達(dá)64.96%。

3 結(jié)論

采用Plackett－Burman(PB)實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析對反膠團(tuán)萃取紅豆蛋白質(zhì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。首先，采用Plackett－Burman設(shè)計(jì)從影響反膠團(tuán)萃取的效果的7因素組合實(shí)驗(yàn)中篩選出具有顯著效應(yīng)的3個(gè)因素:萃取時(shí)間、水相pH、CTAB濃度。在此基礎(chǔ)上，通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最大萃取率區(qū)域，然后Box－Behnken對顯著因素進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳萃取工藝條件為pH為4.3、NaCl濃度0.02mol/L、CTAB濃度40.24mmol/L、蛋白質(zhì)濃度2mg/mL、萃取時(shí)間90min、萃取溫度20℃。萃取條件優(yōu)化后實(shí)驗(yàn)測得紅豆萃取率為56.85%。溫度為20℃，含NaCl濃度為1.1mol/L的pH為6.0緩沖溶液進(jìn)行蛋白質(zhì)反萃取，反萃取率可達(dá)64.96%。

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