應(yīng)用SRAP標(biāo)記對(duì)六個(gè)灰樹(shù)花的多態(tài)性分析

尹永剛，胡汝曉，李新菊，王春暉，彭運(yùn)祥

(湖南省食用菌研究所，湖南長(zhǎng)沙410013)

灰樹(shù)花(Grifola frondosa(Fr.)Gray)又稱栗蘑、千佛菌、貝葉多孔菌、舞茸，是一種珍貴的大型食藥用真菌。野生灰樹(shù)花大多發(fā)生在板栗、櫟樹(shù)、栲樹(shù)等殼斗科樹(shù)種及闊葉樹(shù)樹(shù)樁基部或倒腐的近地樹(shù)干上，是一種典型的白腐菌，以分解樹(shù)木的心材為營(yíng)養(yǎng)，造成樹(shù)木心材腐朽［1］，其姿態(tài)優(yōu)美，香氣濃郁，味道鮮美，柔軟脆嫩，子實(shí)體富含蛋白質(zhì)、纖維、維生素，是一種深受人民喜愛(ài)的營(yíng)養(yǎng)保健食品［2］，在藥用價(jià)值上具有抗腫瘤、免疫刺激、抗血栓、抗菌、抗病毒、抗糖尿病、抗氧化及增強(qiáng)生命力等多重功效［3］。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于灰樹(shù)花的研究報(bào)道主要集中在栽培技術(shù)和生物活性物質(zhì)成分與功能研究［3－4］等方面，而關(guān)于該菌種的分子生物學(xué)研究報(bào)道較少。由于目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)上菌種管理混亂，以及認(rèn)識(shí)上的混亂致使“同名異物、同物異名”的現(xiàn)象普遍存在，給科研帶來(lái)許多不必要的重復(fù)，也阻礙了菌種的調(diào)劑供給。由于技術(shù)上的復(fù)雜性，傳統(tǒng)的鑒定方法如拮抗、同工酶分子等技術(shù)已經(jīng)跟不上科技的發(fā)展，而標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)大大的降低了解決這一問(wèn)題的困難。序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence－related amplified polymorphic，SRAP)標(biāo)記技術(shù)是2001年由Li和Quiros開(kāi)發(fā)出的一種新型的基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)［5］。該標(biāo)記是通過(guò)獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對(duì)ORFs(Open Reading Frames)進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物長(zhǎng)17bp，下游引物長(zhǎng)18bp，對(duì)內(nèi)含子區(qū)域、啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增［6］。因不同個(gè)體、物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子及間隔區(qū)長(zhǎng)度不同而產(chǎn)生多態(tài)性。該標(biāo)記具有檢測(cè)簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，每對(duì)引物都能夠產(chǎn)生適度的多態(tài)性標(biāo)記，而且其中一部分是共顯性標(biāo)記，能夠比較容易地分離目的標(biāo)記并測(cè)序等［7］。目前SRAP標(biāo)記已經(jīng)在香菇 (Lentinula edodes)［8］、黑 木 耳 (Auricularia auricula)［9］、毛木耳(Auricularia polytricha)［10］、榆黃蘑(Pleurotus citrinopileatus)［11］、 平 菇 (Pleurotus ostreatus)［12］等食用菌上有研究報(bào)道。本研究將采用SRAP方法對(duì)6個(gè)灰樹(shù)花栽培品種進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，探討不同灰樹(shù)花的親緣關(guān)系及該分子標(biāo)記的多態(tài)性分析等問(wèn)題，并準(zhǔn)確地對(duì)灰樹(shù)花菌種進(jìn)行遺傳分類，為灰樹(shù)花種植資源的遺傳多樣性和灰樹(shù)花育種親本選配研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰樹(shù)花(Gf1) 湖南省食用菌研究所;灰樹(shù)花－1(Gf2)北京市農(nóng)林科學(xué)院;灰樹(shù)花3號(hào)(Gf3)、灰樹(shù)花5號(hào)(Gf4)、灰樹(shù)花53號(hào)(Gf5)三明真菌研究所;灰樹(shù)花15(Gf6)浙江慶元;植物基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化公司;瓊脂糖 西班牙Biowest公司;Taq buffer(Mg2+)、dNTPs、Taq DNA 聚合酶 大連寶生物工程有限公司;葡萄糖、MgSO4、KH2PO4、蛋白胨 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純;引物 上海生工生物工程有限公司;溴化乙腚美國(guó)Sigma公司;1Kb Plus DNA Ladder 北京中科瑞泰生物公司。

電泳儀JY600C 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;HYG－A型恒溫振蕩搖瓶柜 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;Eppendorf 5415R臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;Eppendorf Mastercycler gradient PCR儀 德國(guó)Eppendorf公司;Bio－Rad凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)Bio－Rad公司;Thermo精密綜合培養(yǎng)箱、Thermo生物安全柜 美國(guó)Thermo公司;Bullet Blender高通量組織研磨儀 美國(guó)Next Advance公司。

1.2 菌絲體培養(yǎng)和基因組DNA提取

將供試菌株分別接種于PDA液體綜合培養(yǎng)基(馬鈴薯 200g，葡萄糖 20g，MgSO41.5g，KH2PO43g，VB10.01g，蛋白胨5g，加水定容至1L)中，置于25℃振蕩培養(yǎng)箱中，130r/min條件下恒溫培養(yǎng)10d。菌絲體基因組DNA采用植物基因組DNA提取試劑盒提取。

1.3 引物與PCR擴(kuò)增

SRAP－PCR擴(kuò)增體系:10×Taq buffer(含Mg2+)5μL，2.5mmol/LdNTPs 1μL，20μmol 引 物 2μL，5U/μL Taq DNA 聚合酶 0.5μL，基因組 DNA 模板1μL(約50ng)，ddH2O 補(bǔ)足50μL。反應(yīng)程序?yàn)?94℃5min;94℃ 1min，35℃ 1min，72℃ 1min，5 個(gè)循環(huán);94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min，35 個(gè)循環(huán);72℃10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后拍照記錄。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對(duì)獲得的電泳圖譜進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)，有帶的地方記為1，無(wú)帶的地方記為0，用Excel軟件將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成0/1矩陣;用NTSYS pc2.10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)原始矩陣用SIMQUAL程序求Jaccard相似系數(shù)矩陣，并獲得相似系數(shù)矩陣，用SHAN程序中的UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，并通過(guò)Tree Plot模塊生成親緣關(guān)系聚類圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 SRAP分析

對(duì)6株灰樹(shù)花的基因組DNA進(jìn)行SRAP－PCR的統(tǒng)計(jì)分析(表1)，14對(duì)引物組合共擴(kuò)增出151條位點(diǎn)片段，其中多態(tài)性片段132條，占總片段條數(shù)的87.4%，多態(tài)性整體較高。每對(duì)引物組合擴(kuò)增條帶數(shù)在7～16條之間，其中引物組合me3/em13(圖1－A)擴(kuò)增帶數(shù)最少，為7條，引物組合me5/em6(圖1－B)擴(kuò)增帶數(shù)最多，為16條。獲得多態(tài)性百分比最高的引物組合為 me1/em15(圖1－D)和 me3/em13，均獲得100%的多態(tài)性片段，而引物組合me2/em3(圖1－C)擴(kuò)增得到的多態(tài)性片段比例最低，為62.5%。

本研究所得的擴(kuò)增帶譜讀取結(jié)果計(jì)算6株灰樹(shù)花菌株之間的Jaccard相似系數(shù)，變化范圍為0.3019～0.7662，其中Gf5和Gf6相似系數(shù)最高，親緣關(guān)系最近，Gf2和Gf4遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)。應(yīng)用UPGMA法聚類，構(gòu)建了6株灰樹(shù)花菌株的SRAP聚類圖(圖2)。對(duì)供試菌株在相似系數(shù)躍變處進(jìn)行分類。在相似系數(shù)為0.45處取一結(jié)合線，供試6個(gè)菌株被分為3個(gè)小組，第一小組為Gf1;第二小組:Gf2和Gf3;第三小組為Gf4、Gf5和Gf6。由此可知，來(lái)自不同地區(qū)的灰樹(shù)花栽培品種可能在引種來(lái)源上有交叉，其中Gf1來(lái)自湖南，被聚為一類。而另一株來(lái)自北京的Gf2同來(lái)福建的Gf3聚為一類，但親緣關(guān)系較遠(yuǎn);另外兩株來(lái)自福建三明真菌研究所的Gf4和Gf5與浙江的Gf6聚為一類，其中Gf5和Gf6最初可能源于同一地區(qū)。

表1 SRAP引物對(duì)灰樹(shù)花DNA擴(kuò)增條帶的多態(tài)性分析Table 1 Polymorphism analysis of the amplified bands of Grifola frondosa genomic DNA generated by SRAP primers

圖1 引物組合 me3/em13、me5/em6、me2/em3、me1/em15分別對(duì)6株灰樹(shù)花的擴(kuò)增圖譜Fig.1 Fingerprints of 6 Grifola frondosa strains generated by the primer combinations of me3/em13，me5/em6，me2/em3 and me1/em15，respectively

圖2 灰樹(shù)花菌株的SRAP聚類圖Fig.2 The dendrogram of Grifola frondosa strains with SRAP method

王守現(xiàn)等［13］采用酯酶同工酶、RAPD和ISSR方法對(duì)北京地區(qū)的6個(gè)灰樹(shù)花菌株進(jìn)行綜合分析，證明可以將6個(gè)菌株進(jìn)行分類，但在該研究報(bào)道的不足之處在于，在RAPD和ISSR方法上，分別僅使用了2個(gè)RAPD引物和1個(gè)ISSR引物，因此對(duì)于菌株間的多樣性分析會(huì)因?yàn)楫a(chǎn)生誤差較大而導(dǎo)致結(jié)果不夠準(zhǔn)確。近年來(lái)，研究學(xué)者們利用SRAP技術(shù)對(duì)香菇、木耳、平菇［8－9，12］多樣性評(píng)價(jià)時(shí)，都可以將種內(nèi)的多個(gè)品種明顯地區(qū)分開(kāi)來(lái)，并達(dá)到分類的效果。Du等［10］應(yīng)用SRAP技術(shù)對(duì)云南地區(qū)的毛木耳野生品種同四川與河南地區(qū)的栽培品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，在不同野生品種存在多樣性的同時(shí)，可將野生品種與栽培品種進(jìn)行區(qū)分，這與地理上位置的差異是一致的，同時(shí)也表明河南與四川地區(qū)的栽培菌可能引源于同一地區(qū)。越來(lái)越多的研究者將分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于食用真菌，如杏鮑菇、雙孢蘑菇和香菇等［14－16］的種間和種內(nèi)不同菌株的鑒定研究。分子標(biāo)記手段較多，因此研究中同時(shí)采取多種分子標(biāo)記比較分析的方法，比如 ISSR［17］、AFLP［18－19］、SSR［20－21］等分子技術(shù)手段，對(duì)物種進(jìn)行親緣關(guān)系和多樣性研究，是今后工作研究的重點(diǎn)。

3 結(jié)論

灰樹(shù)花具有獨(dú)特的食用價(jià)值與藥用價(jià)值，是近年來(lái)被越來(lái)越多的消費(fèi)者喜愛(ài)的珍稀食用菌品種，因此，對(duì)于該品種遺傳學(xué)及育種方面的研究，是今后工作的重點(diǎn)。分子標(biāo)記通常以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核酸序列的變異為基礎(chǔ)，在DNA水平上直接的反映出個(gè)體間的遺傳多態(tài)性，因此，在遺傳育種、基因組作圖、物種親緣關(guān)系鑒定、基因克隆等方面有廣泛應(yīng)用。SRAP是分子標(biāo)記的手段之一，本研究采用該技術(shù)對(duì)湖南、北京、浙江和福建地區(qū)的6個(gè)灰樹(shù)花栽培品種進(jìn)行了親緣關(guān)系與多態(tài)性分析，14對(duì)SRAP引物組合共擴(kuò)增出151條位點(diǎn)片段，其中多態(tài)性片段132條，占總片段條數(shù)的87.4%，菌株間相似系數(shù)變化范圍為0.3019～0.7662，同時(shí)將6個(gè)菌株分為3大類，結(jié)果表明SRAP技術(shù)能夠在分子水平上分析供試菌株之間的親緣關(guān)系，并且能有效的把不同的菌株區(qū)分開(kāi)來(lái)，這也為今后優(yōu)良灰樹(shù)花品種的選育工作提供了有效的參考。

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