柴胡對人食管癌細(xì)胞株Eca-109的抑制作用*

黃種新 杜好信 姚成才

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)2006級本碩連讀研究生 福州 250122；2福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬廈門市中醫(yī)院 廈門 361009）

柴胡對人食管癌細(xì)胞株Eca-109的抑制作用*

黃種新1杜好信2姚成才2

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)2006級本碩連讀研究生 福州 250122；2福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬廈門市中醫(yī)院 廈門 361009）

目的：探討中藥柴胡對人食管癌細(xì)胞株Eca-109的抑制作用。方法：體外培養(yǎng)人食管癌細(xì)胞株(Eca-109)，分別給以不同濃度的柴胡溶液對體外培養(yǎng)的Eca-109細(xì)胞株進(jìn)行干預(yù)。以MTT比色法測定柴胡溶液對Eca-109細(xì)胞株的抑制增殖的作用，計算其細(xì)胞增殖存活率。結(jié)果：MTT實驗顯示柴胡溶液可以明顯抑制Eca-109細(xì)胞株的增殖。用藥后Eca-109細(xì)胞增殖存活率下降幅度與劑量呈正相。結(jié)論：中藥柴胡在體外具有抗腫瘤作用，其機(jī)制是抑制腫瘤細(xì)胞增殖，及抑制細(xì)胞的分化而達(dá)到抗腫瘤的目的。

柴胡；食管癌細(xì)胞；抑制作用

柴胡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為傘形科植物，是我國的傳統(tǒng)中藥和常用中藥，其性味苦涼，有疏散退熱、疏肝解郁、升陽舉氣之功效。用于治療寒熱往來、胸滿脅痛、口苦耳聾、頭痛目眩等[1]。柴胡主要成分為柴胡皂苷（saikosapoins a、b、c、d 四種）、甾醇、揮發(fā)油、脂肪酸和多糖等。有文獻(xiàn)報道了有關(guān)柴胡皂苷抗腫瘤作用的研究成果[2]。本研究以人食管癌Eca-109細(xì)胞為材料，觀察中藥柴胡對這種細(xì)胞株生長的影響作用。旨在探索柴胡對人食管癌細(xì)胞株的抑制作用，為進(jìn)一步研究其抑制作用及指導(dǎo)臨床實踐提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人食管癌細(xì)胞株Eca-109，購自上海細(xì)胞庫。

1.2 主要化學(xué)試劑 MTT購置于Sigma公司，胎牛血清購置于杭州試劑生物工程材料有限公司，青霉素購置于廈門泰京有限公司。

1.3 儀器 培養(yǎng)箱（REVCO）、酶聯(lián)免疫檢測儀（KHB）、高速離心機(jī)、普通離心機(jī)、XHQ-A型旋渦混合器、DK-8D型電熱恒溫水箱、UNO-II型PCR擴(kuò)增儀（Biemetra）、DYY-IIITB 型水平電泳儀、DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、流式細(xì)胞儀、隔水式電熱恒溫箱、震蕩混勻器、恒溫干燥箱等。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人食管癌細(xì)胞株Eca-109在10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿底80%～90%時，進(jìn)行傳代，傳代時吸除培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗兩次，0.5 mL 0.25%胰酶進(jìn)行消化。根據(jù)實驗需要，將細(xì)胞接種于不同規(guī)格的培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。將柴胡溶液溶于未加胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，配制成0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的濃度用于實驗。

2.2 細(xì)胞增殖存活率測定（MTT法） 將對數(shù)生長期的細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/L，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μL(每孔5×103個細(xì)胞)；細(xì)胞接種24 h后，開始加入藥物進(jìn)行處理（不同濃度）；每孔加入20 μL的5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸除MTT溶液，每孔加入150 μL的DMSO；脫色搖床搖動10 min后，酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm時各孔OD值；根據(jù)公式：細(xì)胞抑制率=（OD對照組－OD給藥組）/OD對照組×100%計算出各組細(xì)胞的增殖存活率。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Origin7.5軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)以(±S)表示，進(jìn)行單因素方差分析及其他相關(guān)統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

采用MTT法測定Eca-109經(jīng)不同濃度中藥柴胡溶液（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL）處理 24 h后的細(xì)胞增殖存活率。從表1結(jié)果可以看出，與對照組相比，不同濃度柴胡溶液組均有統(tǒng)計學(xué)差異。Eca-109在0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的柴胡溶液作用 24 h 后其細(xì)胞增殖存活率呈明顯的遞減趨勢。說明柴胡溶液在體外對Eca-109具有明顯的存活抑制作用，它們的增殖存活率與柴胡溶液呈明顯的劑量依賴關(guān)系。

表1 不同濃度柴胡溶液處理24 h后的Eca-109增殖存活率 (±S) %

表1 不同濃度柴胡溶液處理24 h后的Eca-109增殖存活率 (±S) %

組別 Eca-109增殖存活率 P值對照組0.5 mg/mL 1.0 mg/mL 1.5 mg/mL 2.0 mg/mL 100 75.56±7.30 57.74±10.51 55.95±12.40 26.35±6.55＜0.05＜0.05＜0.01＜0.01

4 討論

食管癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康。全世界每年有20余萬人死于食管癌，我國每年死亡達(dá)15萬人，占據(jù)世界食管癌死亡人數(shù)的大部分。在我國，食管癌發(fā)病率男性居各種惡性腫瘤第四位，女性為第七位，而死亡率男女均居第四位。盡管國內(nèi)外醫(yī)學(xué)工作者經(jīng)過幾十年的探索實踐，在食管癌的防治方面取得很大的成績，但食管癌的具體發(fā)病機(jī)制仍然不十分清楚，以手術(shù)、化療、放療為主的綜合治療手段仍不盡如人意，尤其在藥物治療方面，食管癌對化療藥物敏感性很差，化療效果有限，食管癌的預(yù)后仍較差。當(dāng)前的研究顯示，食管癌缺乏對各種常見抗腫瘤藥物的敏感性，導(dǎo)致其化療的療效低下。近年來，由于分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，各種分子靶點治療藥物的開發(fā)研究猶如雨后春筍，令包括食管癌在內(nèi)的惡性腫瘤防治研究展現(xiàn)出新的活力。本研究證實中藥柴胡在體外具有抗腫瘤作用，為未來開發(fā)出相關(guān)新的、效果明顯的食管癌化療藥物或者新的輔助化療藥物提供理論基礎(chǔ)。

國內(nèi)外學(xué)者也對柴胡的抗腫瘤作用做了臨床和實驗研究。陳靜波等[3]、夏薇等[4]通過給予不同濃度的柴胡皂苷d(SSd)分別作用于HL-60細(xì)胞以及K562細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，SSd對HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用呈時間-劑量依賴關(guān)系；Chiang等[5]研究發(fā)現(xiàn)SSd通過激活Caspase(胱門冬蛋白酶)3和7，引起多聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶(po1y-ADP-ribose-po1ymerase,PARP)的分裂從而誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡。Hsu等[6～7]發(fā)現(xiàn)SSd對引起細(xì)胞凋亡的受體Fas和Fas配體的表達(dá)均有明顯的促進(jìn)作用，可引起G1期細(xì)胞的堆積。劉殿菊等[8]應(yīng)用血清藥理學(xué)方法在體外證實了柴胡含藥血清的抗腫瘤活性。

本研究結(jié)果顯示：柴胡溶液對Eca-109細(xì)胞有明顯的抑制作用，且與劑量相關(guān)，柴胡溶液的抑制作用隨濃度增加而增加(P＜0.05)。說明柴胡溶液在體外對食管癌細(xì)胞的生長增殖有明顯的抑制作用，有可能是一種有希望的抗癌中藥。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，必將對中藥柴胡及類似藥物抗腫瘤抑制作用的研究起到很大的推動作用，針對這些機(jī)制的研究有希望開發(fā)出新型的抗腫瘤藥物。

[1]李家邦.中醫(yī)學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006.138-139,223

[2]王艷麗,和水祥,羅金燕.柴胡皂苷抗腫瘤機(jī)制研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報,2006,1(4):98-100

[3]陳靜波,夏薇,崔清潭.柴胡皂甙d(SSd)對HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用[J].北華大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2001,2(6):486-488

[4]夏薇,崔新羽,崔清潭.柴胡皂甙d(SSd)對K562細(xì)胞增殖的抑制作用[J].北華大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2002,3(2):113-115

[5]Chiang LC,Ng LT,Liu LT,et a1.Cy-totoxicity and anti-hepatitis B virus activities of saikosaponins from Bup-1eurum species[J].P1anta Med,2003,69(8):705-709

[6]Hsu YL,Kuo PL,Chiang LC,et a1.Invo1vement of p53,nuc1ear factor kappaB and Fas/Fas 1igand in induction of apoptosis and ce11 cyc1e arrest by saikosaponind in human hepatoma ce11 1ines[J].Cancer Lett,2004,213(2):213-221

[7]Hsu YL,Kuo PL,Lin CC.The pro1if-erative inhibition and apoptotic mechanism of Saikosaponin D in human non-sma11 ce11 1ung cancer A549 ce11s[J].Life Sci,2004,75(10):1 231-1 242

[8]劉殿菊,關(guān)霞.柴胡含藥血清的體外抗腫瘤作用的實驗研究[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2011,12(2):76-77

Objective:To investigate the inhibitory effect of Radix Bup1euri on human esophagea1 cancer ce11 Eca-109.Methods:In vitro cu1ture of human esophagea1 cancer ce11(Eca-109),were treated with different concentration of RadixBup1eurum so1ution on Eca-109 in vitro intervention.Inhibition of pro1iferation was measured Radix with MTT co1orimetric method,to ca1cu1ate the ce11 pro1iferation,surviva1 rate.Resu1ts:MTT showed Bup1eurum so1ution can significant1y inhibit the pro1iferation of Eca-109 ce11s.After the pro1iferation of Eca-109 ce11 surviva1 rate decreased with the dose of positive.Conc1usion:Radix Bup1euri has antitum or effect in vitro,the mechanism is to inhibit the pro1iferation of tumor ce11s,and inhibited ce11 differentiationand achieve the purpose of anti tumor.

Radix bup1euri;Esophagus carcinoma ce11;Inhibition

福建廈門市科技局科研項目(項目編號：3502Z20077064)

R 285.5

B

10.3969/j.issn.1671-4040.2013.04.058

2013-03-13）