高壓CO2處理對(duì)香蕉果肉中多酚氧化酶活性的影響

汪少華，曹清明 ，余元善，徐玉娟，肖更生，吳繼軍，唐道邦

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410004;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東廣州510610)

近些年來(lái)，中國(guó)香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，目前已成為南亞熱帶地區(qū)的最大宗水果。目前香蕉主要以鮮食為主，深加工較少，其主要原因是香蕉在剝皮、切片、打漿榨汁等過(guò)程中極易產(chǎn)生組織褐變現(xiàn)象［1］。香蕉加工中的酶促褐變主要是由多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)引起的［2］。為了抑制香蕉果肉中多酚氧化酶引起的褐變，傳統(tǒng)的方法是通過(guò)熱加工或一些化學(xué)護(hù)色劑(檸檬酸、亞硫酸鹽和抗壞血酸等)來(lái)鈍化或抑制香蕉果肉中多酚氧化酶活力。熱加工易使產(chǎn)品產(chǎn)生蒸煮味，并對(duì)香蕉中的營(yíng)養(yǎng)成分破壞較大，而護(hù)色工藝本身不能完全鈍化香蕉果肉中的多酚氧化酶，且護(hù)色劑的添加容易產(chǎn)生一系列的食品安全問(wèn)題，對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味也有一定的影響［3－4］。因此，尋找新的加工方法來(lái)鈍化香蕉果肉中的多酚氧化酶，并減少對(duì)其營(yíng)養(yǎng)成分的破壞是提高香蕉產(chǎn)品品質(zhì)，實(shí)現(xiàn)高附加值的有效途徑。高壓二氧化碳技術(shù)是目前發(fā)展較快的一種新型的非熱加工技術(shù)，它克服了熱加工造成的種種弊端［5－6］。研究表明，在一定的壓力下(3～30MPa)，二氧化碳對(duì)食品中微生物具有殺滅效果，同時(shí)能使部分酶鈍化。目前，關(guān)于高壓二氧化碳技術(shù)對(duì)食品中微生物的滅菌效果研究較多，但對(duì)食品內(nèi)源酶鈍化作用的研究相對(duì)較少。幾項(xiàng)研究表明，高壓二氧化碳技術(shù)處理能有效降低多種酶的活性，并認(rèn)為酶活性的降低與酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中α－螺旋結(jié)構(gòu)變化有關(guān)［7－9］。Ishkawa 等［10］發(fā)現(xiàn)，在25MPa、35℃、30min的超臨界二氧化碳的處理下，脂肪酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶以及葡萄糖氧化酶的活性分別為處理前的62.9%、31.3%、37.6%、12.4%，同時(shí)觀察到處理后α－螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，可能是這種變化導(dǎo)致了酶活性的變化。目前，評(píng)價(jià)高壓CO2處理在香蕉果肉鈍酶護(hù)色方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本文比較了CO2壓力、溫度和處理時(shí)間對(duì)香蕉果肉中多酚氧化酶鈍化的影響，并且采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化了高壓二氧化碳對(duì)香蕉果肉中多酚氧化酶的鈍化工藝，為高壓CO2處理在香蕉果肉鈍酶護(hù)色研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香蕉 屬于廣州本地蕉品種，表皮黃色，購(gòu)自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng);99.5%二氧化碳?xì)怏w 廣州龍奧氣體設(shè)備有限公司;其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DJ12B－A11打漿機(jī) 九陽(yáng)打漿機(jī);B－25高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠;UV－1800紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司;5702R型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)eppendorf公司;50MPa－11B高壓二氧化碳處理設(shè)備 杭州華黎泵業(yè)有限公司研制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香蕉果肉的高壓CO2處理方法 將切成長(zhǎng)1cm小段的香蕉果肉(約100g)，置于高壓CO2裝置的樣品處理室中。調(diào)節(jié)處理室的溫度和CO2的壓力到設(shè)定值(約5～6min)后，恒溫恒壓保持一定的時(shí)間，緩慢釋放CO2到正常大氣壓(約5～6min)后，取出樣品用于后續(xù)的多酚氧化酶活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 香蕉果肉中殘留的多酚氧化酶活力測(cè)定 取處理后的樣品香蕉果肉(100g)與250mL的0.1mol/L磷酸鈉鹽緩沖液體(pH5.5)混合，同時(shí)添加3.5g PVPP(聚乙烯吡咯烷酮)和3.5mLTriton X－100;放置在打漿機(jī)中中速處理3min后，轉(zhuǎn)入500mL燒杯中高速均質(zhì)5min;將上述均質(zhì)后的樣品于4℃下10000×g，離心10min，上清液即是香蕉果肉中殘留的多酚氧化酶液。多酚氧化酶活力測(cè)定采用鄰苯二酚法［11］。具體為:20μL待測(cè)樣品酶液、2mL 50mmol/L的磷酸鈉鹽緩沖液(pH7.0)和0.5mL 50 mol/L鄰苯二酚水溶液充分混合，反應(yīng)體系溫度為30℃，立即置于分光光度計(jì)中，測(cè)定并監(jiān)控OD420值的變化，以每分鐘ΔOD420變化0.001所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。結(jié)果以殘留的多酚氧化酶活表示，多酚氧化酶活殘留率(%)=處理后的酶活力(A)/處理前的酶活力(A0)×100。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 不同CO2壓力對(duì)香蕉果肉中多酚氧化酶活殘留率的影響 香蕉果肉分別在5、10、15、20、25MPa的高壓CO2下處理20min(55℃)后，測(cè)定其殘留的多酚氧化酶活。

1.2.3.2 不同溫度對(duì)香蕉果肉中多酚氧化酶活殘留率的影響 香蕉果肉分別在30、40、50、55、60℃下經(jīng)20MPa的高壓CO2處理時(shí)間20min后，測(cè)定其殘留的多酚氧化酶活。

1.2.3.3 不同處理時(shí)間對(duì)香蕉果肉中多酚氧化酶活殘留率的影響 香蕉果肉在20MPa的高壓CO2處理(55℃)下分別處理 0、20、40、50、60、80min 后，測(cè)定其殘留的多酚氧化酶活。

1.2.4 鈍酶條件的優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以降低香蕉果肉中殘留的多酚氧化酶活為指標(biāo)，采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方法優(yōu)化對(duì)高壓CO2處理鈍酶影響最顯著的因素(CO2壓力、溫度、處理時(shí)間)，表1列出了各因素的水平編碼表。

表1 因素水平編碼表Table 1 Code of factors and levels

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 統(tǒng) 計(jì) 分 析 軟 件 DX6Trial［12－13］對(duì) 數(shù) 據(jù) 進(jìn) 行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同CO2壓力對(duì)香蕉果肉中多酚氧化酶活殘留率的影響 由圖1可知，在55℃、處理時(shí)間為20min的條件下，香蕉果肉中殘留的多酚氧化酶活隨著壓力的增大而快速降低。在15MPa以下時(shí)，隨著CO2壓力的提高，香蕉果肉中多酚氧化酶的鈍化率顯著提高，而在15MPa以上時(shí)，隨著CO2壓力的提高，香蕉果肉中多酚氧化酶的鈍化率并沒(méi)有顯著提高(p＞0.05)。

圖1 不同壓力的高壓CO2處理香蕉果肉后其多酚氧化酶活殘留率Fig.1 Relative residual activity of ployphenol oxidase in banana pulp exposed to various pressure of high pressure carbon dioxide at 55℃for 20 min

2.1.2 不同溫度對(duì)香蕉果肉中多酚氧化酶活殘留率的影響 由圖2可知，隨著溫度的提高，香蕉果肉中多酚氧化酶的鈍化速率明顯提高，50℃是高壓CO2鈍化香蕉果肉中多酚氧化酶的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)，當(dāng)溫度低于50℃，高壓CO2鈍化香蕉果肉多酚氧化酶的效率一般，但當(dāng)溫度高于50℃后，高壓CO2鈍化香蕉果肉多酚氧化酶的效率顯著提高。例如，香蕉果肉在60℃下經(jīng)20MPa的高壓CO2處理時(shí)間20min后殘留的酶活力少于10%，而香蕉果肉在30℃同樣的壓力和時(shí)間處理下，果肉中的多酚氧化酶幾乎沒(méi)有鈍化。

圖2 香蕉果肉經(jīng)不同溫度的高壓CO2(20MPa，20min)處理后其多酚氧化酶活殘留率Fig.2 Relative residual activity of ployphenol oxidase in banana pulp exposed to various temperature of high pressure carbon dioxide at 20 MPa for 20 min

2.1.3 處理時(shí)間對(duì)香蕉果肉中多酚氧化酶活殘留率的影響 由圖3可知，香蕉果肉55℃經(jīng)20MPa的高壓CO2處理20min后，多酚氧化酶的殘留率急劇下降，為21.5%，若繼續(xù)延長(zhǎng)處理時(shí)間到80min后，多酚氧化酶的殘留率僅下降到9.8%。所以香蕉果肉中多酚氧化酶在高壓CO2處理20min時(shí)，其多酚氧化酶的殘留率下降呈關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)，即處理20min之前，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚氧化酶的殘留率呈迅速下降狀態(tài)，為快速鈍化期;當(dāng)處理20min之后，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚氧化酶殘留率呈緩慢下降狀態(tài)，進(jìn)入緩慢鈍化期。

圖3 香蕉果肉經(jīng)高壓CO2(20MPa，55℃)處理不同時(shí)間后多酚氧化酶活殘留率的變化Fig.3 Change of relative residual activity of ployphenol oxidase in banana pulp exposed to high pressure carbon dioxide(20 MPa)for 20 min at 55℃

2.2 鈍酶條件的優(yōu)化

綜合單因素實(shí)驗(yàn)影響結(jié)果，選取CO2壓力、溫度和處理時(shí)間對(duì)高壓CO2處理鈍酶影響最顯著的因素，確定各因素的上、下限，按二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方法確定因素及水平(表1)。采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)將因素水平設(shè)計(jì)成23個(gè)實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到香蕉果肉中多酚氧化酶的殘留率(Y)對(duì)溫度(X1)、CO2壓力(X2)、處理時(shí)間(X3)的二次多項(xiàng)回歸方程為:Y=0.16－0.13X1－0.039X2－0.077X3+0.015+0.04+0.022+0.026X1X2+0.013X1X3+0.00675X2X3。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experiment Design and Results

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。從方差分析結(jié)果來(lái)看，模型的顯著性檢驗(yàn)p＜0.01，表明該模型具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型中 X1、X2、X3、極顯著，顯著，其它項(xiàng)不顯著。對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，剔除不顯著交互作用，回歸分析得到Y(jié)對(duì)X1、X2、X3的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為:Y=0.16 －0.13X1－0.039X2－0.077X3+0.04+0.022。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，對(duì)于高壓CO2處理對(duì)香蕉果肉中多酚氧化酶的酶活殘留率，一次項(xiàng)系數(shù)估計(jì)值的絕對(duì)值X1＞X3＞X2，說(shuō)明溫度對(duì)多酚氧化酶的酶活殘留率影響最大，其次是時(shí)間，最小是CO2壓力。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

最后，通過(guò)DX6Trial軟件的優(yōu)化功能及數(shù)學(xué)求偏導(dǎo)，獲得了高壓CO2處理后香蕉果肉中多酚氧化酶活殘留率最小響應(yīng)值及其所對(duì)應(yīng)的因素條件。他們分別是在19.91MPa的高壓CO2下于59.33℃處理50min，此時(shí)香蕉果肉中多酚氧化酶活殘留率為0.81%。考慮到成本問(wèn)題及各因素對(duì)響應(yīng)值的影響順序，選擇最優(yōu)處理?xiàng)l件為壓力19MPa、溫度60℃和保壓時(shí)間50min，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，香蕉果肉的多酚氧化酶活殘留率為0.9%，與理論預(yù)測(cè)值相近。

3 結(jié)論

3.1 在香蕉果肉的高壓CO2處理鈍酶期間，影響香蕉果肉中多酚氧化酶活殘留率的因素大小順序依次是處理溫度、處理時(shí)間和壓力。

3.2 采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)法優(yōu)化了香蕉果肉的高壓CO2處理鈍酶條件，并獲得相關(guān)的回歸模型。優(yōu)化后的香蕉果肉的高壓CO2處理鈍酶條件是19MPa的高壓CO2在60℃下處理50min，處理后香蕉果肉的多酚氧化酶活殘留率僅為0.9%。

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