中國(guó)水牛乳中α-乳白蛋白活性分離方法比較

李 紅，楊同香，薛一為，劉小玲，2，李全陽(yáng)，2，*

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西食品藥品安全評(píng)價(jià)人才小高地建設(shè)載體單位-廣西大學(xué)食品質(zhì)量與安全研究中心，廣西南寧530005）

獨(dú)特的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)賦予α-乳白蛋白突出的功能特性和生物學(xué)活性，使其在食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)具有廣泛應(yīng)用。在臨床領(lǐng)域，α-乳白蛋白擁有的備受關(guān)注的生物學(xué)活性主要包括抗氧化、降血壓、抗癌、降血脂、抗病毒、抗菌、結(jié)合金屬螯合劑等[1]，臨床表現(xiàn)為維持和提高機(jī)體免疫力、延緩衰老、維持腎功能、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、防治心血管及消化系統(tǒng)疾病等[2]。α-乳白蛋白之所以具有如此突出的加工特性和豐富的生物學(xué)活性，與其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，而活性分離純化作為研究結(jié)構(gòu)特性的基礎(chǔ)，也成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)。許多研究利用α-乳白蛋白和其他乳清蛋白成分在不同溫度、pH、酶凝條件及離子條件下溶解度的不同對(duì)其進(jìn)行分離和純化[3-4]。目前對(duì)水牛乳中α-乳白蛋白特性研究匱乏，活性分離水牛乳中α-乳白蛋白具有重要意義。在摸索分離方法的同時(shí)，也為后期繼續(xù)深入研究水牛乳中α-乳白蛋白的功能特性、結(jié)構(gòu)特性和生物學(xué)活性提供物質(zhì)保障。國(guó)內(nèi)外有關(guān)α-乳白蛋白分離方法的研究很廣泛，但其主要是關(guān)注分離產(chǎn)物α-乳白蛋白的純度及得率，對(duì)分離產(chǎn)物α-乳白蛋白的活性關(guān)注較少[5]。本實(shí)驗(yàn)，選用了兩種在α-乳白蛋白分離工藝中常用的實(shí)驗(yàn)方法，總結(jié)前人分離工藝的同時(shí)，對(duì)分離工藝進(jìn)行優(yōu)化，在優(yōu)化過(guò)程中對(duì)分離產(chǎn)物α-乳白蛋白的純度、得率和活性均進(jìn)行了分析檢測(cè)，以期為實(shí)驗(yàn)室研究和工業(yè)生產(chǎn)分離活性α-乳白蛋白提供借鑒方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮水牛乳 購(gòu)于廣西南寧市奶水牛專業(yè)養(yǎng)殖場(chǎng)；考馬斯亮藍(lán)R-250、丙烯酰胺、溴酚藍(lán)、三羥甲基氨基甲烷（Tris-Base）、甘油、牛血清白蛋白 Mbchem公司；四甲基乙二胺（TEMED）、SDS十二烷基硫酸鈉 Sigma公司；甘氨酸（Glycine）MD原裝；N，N’-亞甲基甲叉雙丙烯酰胺 Fluka公司；β-巰基乙醇、冰乙酸、無(wú)水乙醇、三氯化鐵、氯化鈣、氯化鈉、鹽酸均為分析純。

磁力攪拌儀 上海滬西分析儀器廠；高速冷凍離心機(jī) 上海利鑫堅(jiān)離心機(jī)有限公司；電泳裝置 Bio-Rad；卷式膜小型實(shí)驗(yàn)機(jī) 大連屹東膜技術(shù)工程設(shè)備有限公司；超濾膜 截留分子量10000u；透析袋 分子截留量10000u；超濾管 分子截留量10000u等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 等電點(diǎn)緩慢酸沉去除酪蛋白 新鮮水牛乳，于4℃ 8000×g條件下高速離心30min后，將上層脂肪去除，采用0.2mol/L冰乙酸緩慢調(diào)節(jié)牛乳pH至4.5～4.7，4℃ 8000×g條件下高速離心30min后保留上清液，采用0.2MPa壓力，截留分子量10000u的超濾膜超濾，收集大分子量截留液，凍干，即得到酸乳清蛋白凍干粉末，備用。

1.2.2 鐵鹽沉淀法分離α-乳白蛋白 依據(jù)α-乳白蛋白對(duì)鐵離子具有很強(qiáng)的敏感性，遇鐵即結(jié)合成絮狀析出[6]，采用不同濃度的鐵鹽對(duì)α-乳白蛋白進(jìn)行分離。選用兩種鐵鹽沉淀α-乳白蛋白的pH條件。a.酸乳清凍干粉末溶解后直接加入各濃度鐵鹽，即酸性條件下鐵鹽沉淀α-乳白蛋白；b.將酸乳清凍干粉末溶解后調(diào)節(jié)pH至7.0，再加入各濃度鐵鹽，即中性條件下鐵鹽沉淀α-乳白蛋白。取6.00g酸乳清蛋白凍干粉末，溶于300mL蒸餾水中，置于磁力攪拌儀上溫和攪拌至乳清蛋白粉末完全溶解，將樣品均勻分裝至5個(gè)干凈空燒杯中，在各燒杯中緩慢加入三氯化鐵母液，使三氯化鐵的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到0.005%、0.01%、0.02%、0.04%、0.08%，置于磁力攪拌儀上溫和攪拌30min，使其充分反應(yīng)，隨后于4℃8000×g條件下高速離心20min，收集沉淀，將沉淀溶入適量乙二胺四乙酸二鈉溶液中，0.1mol/L NaOH溶液緩慢調(diào)節(jié)pH至7.0，攪拌使其充分溶解。將沉淀溶解液裝入透析袋中，4℃透析過(guò)夜。采用超濾管將透析液體積濃縮至所需體積。中性條件下鐵鹽沉淀α-乳白蛋白，將酸乳清蛋白粉末溶解調(diào)節(jié)pH至7.0后，步驟與酸性條件下鐵鹽沉淀α-乳白蛋白相同。

1.2.3 鈣鹽沉淀法分離α-乳白蛋白 依據(jù)β-乳球蛋白較α-乳白蛋白對(duì)鈣鹽具有更強(qiáng)的敏感性[7-8]，在鈣鹽存在的條件下，容易發(fā)生沉淀，采用不同濃度的鈣鹽對(duì)二者進(jìn)行分離。取6.00g酸乳清蛋白凍干粉末，溶于300mL蒸餾水中，置于磁力攪拌儀上溫和攪拌至乳清蛋白粉末完全溶解。采用0.1mol/L NaOH調(diào)節(jié)乳清蛋白溶解液的pH至7.0后，將樣品均勻分裝至5個(gè)干凈空燒杯中，在各燒杯中緩慢加入氯化鈣粉末，使氯化鈣的濃度分別達(dá)到0.01、0.02、0.05、0.08、0.10mol/L，置于磁力攪拌儀上溫和攪拌30min，使其充分反應(yīng)，隨后于4℃ 8000×g條件下高速離心20min，收集上清液，裝入透析袋中，4℃透析過(guò)夜。采用超濾管將透析液體積濃縮至所需體積。

1.2.4 蛋白質(zhì)純度鑒定[9]用不連續(xù)SDS-PAGE電泳，根據(jù)相對(duì)分子量對(duì)分離蛋白的純度進(jìn)行檢測(cè)。將過(guò)膜后的待測(cè)樣品濃度稀釋或濃縮至3000μg/mL，移取20μL待測(cè)樣品置于1.5mL的Eppendorf管中，加入40μL樣品處理液（3.55mL去離子水，1.25mL 0.5mol/L Tris-HCl pH6.8，2.5mL甘油，2.0mL 10%十二烷基磺酸鈉（SDS），0.2mL 0.5%溴酚藍(lán)，50μL β-巰基乙醇配制總體積9.55mL樣品處理液）充分混合均勻，在沸水浴中煮沸5min后，高速離心（10000r/min 3min），取上清液進(jìn)行電泳。所用分離膠濃度為15%，堆積膠濃度為5%。樣品在堆積膠中，恒定電壓80V下，電泳時(shí)間約為30min。進(jìn)入分離膠后，恒定電壓120V，電泳時(shí)間約為2～3h。待溴酚藍(lán)至膠板下端1cm左右時(shí)，切斷電源，取下膠板，染色，脫色。

1.2.5 乳清蛋白活性的測(cè)定 根據(jù)凱氏定氮法測(cè)定乳清蛋白活性的方法[10]，凱氏定氮法測(cè)出乳清蛋白液中變性乳清蛋白、活性乳清蛋白及非蛋白氮的總量（總氮W總），隨后使用飽和氯化鈉對(duì)乳清蛋白進(jìn)行沉淀，變性的乳清蛋白發(fā)生沉淀，對(duì)過(guò)濾后未變性的乳清蛋白進(jìn)行凱氏定氮測(cè)定，得到非變性乳清蛋白和非蛋白氮的總量（W1）。樣品的非蛋白氮（NPN）測(cè)定方法如下：采用15%三氯乙酸（W/V）將10mL乳清蛋白液稀釋至50mL，三氯乙酸的最終濃度為12%，這時(shí)所有蛋白質(zhì)均沉淀，對(duì)過(guò)濾后濾液中的非蛋白氮進(jìn)行凱氏定氮測(cè)定，得到NPN的含量。

1.2.6 乳清蛋白含量及得率測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定乳清蛋白含量[11]。首先采用純的牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的測(cè)定過(guò)程：取1mL乳清蛋白液置于試管中，加入5mL考馬斯亮藍(lán)染液，混合均勻后，靜置5min，在595nm處比色測(cè)定樣品的吸光度，隨后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出乳清蛋白的含量。

式中：W1-分離后乳清蛋白的質(zhì)量；W2-分離前乳清蛋白的質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 等電點(diǎn)緩慢酸沉去除酪蛋白的效果

冰乙酸等電點(diǎn)緩慢酸沉去除酪蛋白后樣品純度檢測(cè)效果，見(jiàn)圖1。

由圖1可以明顯看出，0.2mol/L冰乙酸等電點(diǎn)緩慢酸沉去除酪蛋白后的上清液中除了含有微量的乳鐵蛋白和牛血清蛋白，酪蛋白已完全沉淀除去（見(jiàn)泳道2），分離效果良好，該步驟可以達(dá)到將酪蛋白全部除去的效果，分離獲取的乳清蛋白可以滿足繼續(xù)分離α-乳白蛋白的需要。

圖1 冰乙酸等電點(diǎn)緩慢酸沉去除酪蛋白純度效果圖Fig.1 The SDS-PAGE of whey protein using isoelectric precipitation

2.2 鐵鹽沉淀法分離α-乳白蛋白效果

2.2.1 酸性條件下鐵鹽沉淀法分離α-乳白蛋白純度效果 由圖2可以看出，在酸性條件下，當(dāng)鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.005%～0.02%時(shí)，乳清蛋白絮凝沉淀的現(xiàn)象不明顯，沉淀獲取的蛋白通過(guò)電泳檢測(cè)技術(shù)無(wú)法檢出，表明此時(shí)的蛋白濃度過(guò)低，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鐵鹽并不能引起α-乳白蛋白的明顯絮凝沉淀。當(dāng)鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.04%時(shí)，有大量的α-乳白蛋白絮凝沉淀析出（泳道3所示），此時(shí)β-乳球蛋白并未沉淀，α-乳白蛋白條帶單一，純度較高，達(dá)到電泳純。當(dāng)鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.08%時(shí)，在大量α-乳白蛋白絮凝沉淀析出的同時(shí)有大量的β-乳球蛋白沉淀析出，另外還含有微量的牛血清蛋白。此時(shí)α-乳白蛋白的純度反而降低。酸性條件下，鐵鹽沉淀α-乳白蛋白是一個(gè)逐步的過(guò)程，說(shuō)明在酸性條件下，當(dāng)鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.005%～0.04%時(shí)，都還不會(huì)引起β-乳球蛋白沉淀，在前述鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)都有望獲取分離純度高的α-乳白蛋白。

圖2 酸性條件下鐵鹽分離α-乳白蛋白純度效果圖Fig.2 The SDS-PAGE of α-lactalbumin using iron salt precipitation at low pH

2.2.2 酸性條件下鐵鹽分離產(chǎn)物中乳清蛋白活性和得率 由圖3可以看出，鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.005%～0.02%范圍時(shí)，隨著鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，鐵鹽分離產(chǎn)物中乳清蛋白（即α-乳白蛋白）活性比例下降明顯，而得率幾乎保持平穩(wěn)。鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.02%～0.04%范圍時(shí)，隨著鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，鐵鹽分離產(chǎn)物中乳清蛋白（即α-乳白蛋白）活性比例下降趨勢(shì)平緩，而得率明顯逐步增加。當(dāng)鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.08%時(shí)，鐵鹽分離產(chǎn)物中乳清蛋白的得率接近40%，在水牛乳中α-乳白蛋白占乳清蛋白的比例則僅為31.10%[12]，說(shuō)明此時(shí)鐵鹽分離產(chǎn)物中乳清蛋白除了α-乳白蛋白外已混雜了一定量的β-乳球蛋白，降低了α-乳白蛋白的純度。

圖3 酸性條件下鐵鹽分離產(chǎn)物中乳清蛋白活性和得率效果圖Fig.3 The active ratio and recovery of whey protein using iron salt precipitation at low pH

酸性條件下，鐵鹽分離α-乳白蛋白，根據(jù)電泳圖譜，鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.04%時(shí)，有大量的α-乳白蛋白絮凝沉淀析出，且純度較高。而鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.04%時(shí)，α-乳白蛋白絮凝沉淀析出不明顯，在鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.04%時(shí)，會(huì)引起β-乳球蛋白的混雜。結(jié)合活性和得率情況，在鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.04%時(shí)，α-乳白蛋白保持了較好的活性，但得率過(guò)低；當(dāng)鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.08%時(shí)，根據(jù)分離產(chǎn)物中乳清蛋白的得率接近40%可推斷此時(shí)分離產(chǎn)物中乳清蛋白除了α-乳白蛋白外已混雜了一定量的β-乳球蛋白。綜合純度、活性以及得率，在酸性條件下分離純度較高的活性α-乳白蛋白，可采用0.04%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鐵鹽，此時(shí)分離獲取的α-乳白蛋白活性比例和得率分別為44.68%和21.06%。

2.2.3 中性條件下鐵鹽分離α-乳白蛋白純度效果由圖4可以看出，在中性條件下，乳清蛋白對(duì)鐵鹽的敏感性很強(qiáng)，鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.005%時(shí)，即有α-乳白蛋白絮凝沉淀析出，此時(shí)除了同時(shí)有微量的牛血清蛋白外，α-乳白蛋白條帶單一，純度較高。當(dāng)鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.01%～0.08%范圍內(nèi)逐步增大時(shí)，在α-乳白蛋白大量絮凝析出的同時(shí)，β-乳球蛋白也同時(shí)絮凝沉淀析出，此時(shí)β-乳球蛋白的混雜影響了α-乳白蛋白的純度。

2.2.4 中性條件下鐵鹽分離產(chǎn)物中的乳清蛋白活性和得率效果 由圖5可以看出，鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.005%～0.02%范圍內(nèi)，隨著鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，鐵鹽分離產(chǎn)物中乳清蛋白的活性比例明顯下降而得率明顯上升，在鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%～0.08%范圍內(nèi)，隨著鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，鐵鹽分離產(chǎn)物中乳清蛋白的活性比例的下降趨勢(shì)和得率的升高趨勢(shì)均減緩，直至平穩(wěn)。且鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.04%～0.08%時(shí)，鐵鹽分離產(chǎn)物中乳清蛋白的得率超過(guò)了水牛乳中α-乳白蛋白占乳清蛋白31.10%的比例，說(shuō)明此時(shí)β-乳球蛋白的混雜現(xiàn)象已很明顯，與電泳圖顯示結(jié)果相一致。

圖4 中性條件下鐵鹽分離α-乳白蛋白純度效果圖Fig.4 The SDS-PAGE of α-lactalbumin using iron salt precipitation at neutral pH

圖5 中性條件下鐵鹽分離產(chǎn)物中乳清蛋白活性和得率效果圖Fig.5 The active ratio and recovery of whey protein using iron salt precipitation at neutral pH

結(jié)合電泳圖譜，只有在鐵鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.005%的條件下，絮凝沉淀析出的組分單一，可以獲取純度較高的α-乳白蛋白。結(jié)合鐵鹽分離產(chǎn)物中乳清蛋白的活性和得率圖譜，此時(shí)，鐵鹽分離產(chǎn)物僅為α-乳白蛋白，其保持了最強(qiáng)的活性，只是得率也較低。但為了保證α-乳白蛋白的分離純度，在中性條件下分離純度較高的活性α-乳白蛋白仍建議采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.005%的鐵鹽，此時(shí)分離獲取的α-乳白蛋白活性比例和得率分別為64.00%和13.23%。

2.3 鈣鹽沉淀法分離α-乳白蛋白效果

2.3.1 鈣鹽沉淀法分離α-乳白蛋白純度效果 由圖6可以看出，鈣離子濃度在0.01～0.1mol/L范圍內(nèi)增大時(shí)，除去沉淀的上清液中均含有大量的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，隨著鈣離子濃度的增大，絮凝沉淀除去β-乳球蛋白的效果并不理想。說(shuō)明通過(guò)鈣離子單獨(dú)絮凝沉淀分離獲得α-乳白蛋白的效果不夠理想。

2.3.2 鈣鹽沉淀法分離產(chǎn)物中乳清蛋白活性和得率效果 據(jù)圖7可以看出，鈣離子濃度在0.01～0.1mol/L范圍內(nèi)增大時(shí)，鈣鹽沉淀乳清蛋白上清液中的乳清蛋白的活性，隨著鈣鹽濃度的增大呈現(xiàn)緩慢的減小趨勢(shì)，但最低值亦高于60%。而隨著鈣鹽濃度的逐漸增大，鈣鹽沉淀乳清蛋白上清液中的乳清蛋白的得率緩慢下降，但下降并不明顯。說(shuō)明鈣鹽對(duì)乳清蛋白的活性影響較小，同時(shí)，引起乳清蛋白絮凝沉淀析出的能力也較弱。

圖6 鈣鹽沉淀法分離α-乳白蛋白（上清液）純度效果圖Fig.6 The SDS-PAGE of α-lactalbumin using calcium precipitation

圖7 鈣鹽分離產(chǎn)物中乳清蛋白活性和得率效果圖Fig.7 The active ratio and recovery of whey protein using calcium precipitation

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，相對(duì)α-乳白蛋白而言，β-乳球蛋白對(duì)鈣離子具有更強(qiáng)的敏感性[7]，遇鈣離子更易絮凝沉淀析出。鈣鹽分離α-乳白蛋白時(shí)，主要依據(jù)的性質(zhì)是β-乳球蛋白遇鈣的敏感性較強(qiáng)，但根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同鈣鹽濃度處理乳清蛋白后的上清液中，均有α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的混雜現(xiàn)象出現(xiàn)，說(shuō)明二者對(duì)鈣鹽敏感性差異并不明顯，故不建議采用該種方法對(duì)α-乳白蛋白進(jìn)行活性分離。

3 結(jié)論

采用0.2mol/L冰乙酸沉淀去除酪蛋白；對(duì)比酸性條件下和中性條件下鐵鹽分離α-乳白蛋白的最佳效果，在兩種方法皆可保證α-乳白蛋白純度達(dá)到電泳純的同時(shí)，前者的活性比例和得率分別為44.68%和21.06%，后者的活性比例和得率分別為64.00%和13.23%。由此可知，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.04%的鐵鹽在酸性條件下分離α-乳白蛋白可適當(dāng)?shù)奶岣咂涞寐?，而采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.005%的鐵鹽在中性條件下分離α-乳白蛋白可更好地保持α-乳白蛋白的活性；鈣鹽沉淀法分離α-乳白蛋白的純度較差，不建議采用該方法對(duì)α-乳白蛋白進(jìn)行活性分離。

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