沙棗黃酮提取工藝、抗氧化及抑菌活性研究

王 雅，李家寅，趙春萌，趙 萍

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050）

沙棗（Elaeagnus angustifolia L.）屬胡頹子科胡頹子屬植物，由于其具有抗旱、抗風(fēng)沙、保持水土等特性，在我國(guó)西北地區(qū)廣泛生長(zhǎng)。沙棗樹(shù)作為天然野生植物，其果實(shí)沙棗不受化肥、農(nóng)藥和工業(yè)污染物的污染，富含糖類、蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分[1-3]，營(yíng)養(yǎng)豐富。在我國(guó)民間醫(yī)學(xué)中，沙棗果實(shí)被用來(lái)治療腸炎、腹瀉等疾病[4]。盡管沙棗具有較高的藥用和食用價(jià)值，但尚未被充分開(kāi)發(fā)利用。研究報(bào)道，沙棗果實(shí)、莖葉、樹(shù)皮和花中均含有黃酮類化合物[5-8]，Si C L[9]從沙棗樹(shù)皮提取物中分離得到了7種黃酮類化合物，分別為兒茶素、表兒茶酸、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素、槲皮素、毛地黃黃酮及3，5，7-三羥基-4’-甲氧基黃酮。沙棗果實(shí)原花青素、沙棗花中粗黃酮類物質(zhì)、沙棗葉粗黃酮類化合物及沙棗果皮提取物等均具有一定的抗氧化活性[10-12]。本文對(duì)沙棗黃酮的提取工藝及抗氧化抑菌活性進(jìn)行了研究，以期為沙棗果實(shí)的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棗 于2009年10月采自甘肅騰格里沙漠，自然風(fēng)干后去核粉碎過(guò)40目篩；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH sigma；NKA-9大孔樹(shù)脂 南開(kāi)大學(xué)化工廠；其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純；培養(yǎng)基 細(xì)菌培養(yǎng)用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，霉菌培養(yǎng)用馬鈴薯汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；大腸桿菌（E.coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus spp）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus spp.）、黑曲霉（Aspergillus niger）、毛霉（Mucor racemosus）、青霉（Penicillum）由蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

Cary50型分光光度計(jì) 美國(guó)瓦里安公司；UV-9000型紫外分光光度計(jì) 北京瑞麗分析儀器公司；43型Rancimat油脂氧化測(cè)定儀、743型Rancimat食用油氧化穩(wěn)定性測(cè)定儀 瑞士萬(wàn)通；JY99-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沙棗黃酮的提取工藝優(yōu)化 以乙醇為溶劑，按照設(shè)定條件（料液比、超聲時(shí)間、乙醇濃度、超聲功率）進(jìn)行超聲波輔助提取，用單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化沙棗黃酮的提取工藝。1.2.2黃酮得率的測(cè)定采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法[13]。準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，置于50mL容量瓶中，加50%的乙醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。取配制好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL分別裝入10mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉0.4mL，放置6min，后加入10%硝酸鋁0.4mL，放置6min，再加入4%的氫氧化鈉溶液4mL，加水至刻度，搖勻，放置15min，在505nm下測(cè)定其吸光度，吸光度值Y與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X（mg/mL）之間的回歸關(guān)系為：Y=8.4634X+0.0086，R2=0.9937。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，測(cè)定樣品吸光度，計(jì)算黃酮得率。

1.2.3 沙棗黃酮樣品的制備 沙棗粉碎后在最優(yōu)條件下提取，后經(jīng)NKA-9大孔樹(shù)脂純化，收集黃酮類物質(zhì)，真空冷凍干燥，測(cè)定其黃酮得率。

1.2.4 沙棗黃酮抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 對(duì)DPPH自由基清除能力 參考Aruomaoi[14]的方法。準(zhǔn)確稱取6.3mg DPPH，用60%乙醇溶解定容至250mL，得濃度為0.025mg/mL的DPPH溶液。再將1.2.3制備的樣品配制為0.008、0.016、0.024、0.032、0.040、0.048、0.056、0.064mg/mL的溶液。精確吸取DPPH溶液2.5mL，與2.5mL 60%乙醇溶液混合，以60%乙醇為對(duì)照，測(cè)定溶液在517nm處的吸光度值（A0）。取上述樣液各2.5mL，分別與2.5mL DPPH（0.025mg/mL）溶液混合，混合均勻后靜置30min。以60%乙醇為對(duì)照，測(cè)定各溶液在517nm處的吸光度值（Ai）。取上述樣液各2.5mL，分別與2.5mL 60%乙醇溶液混合均勻，以60%乙醇為對(duì)照，測(cè)定各溶液在517nm處的吸光度值（Aj），得到清除率在一定濃度范圍內(nèi)的線性回歸方程，計(jì)算半數(shù)抑制率IC50（清除率達(dá)50%時(shí)樣品的濃度）。IC50值越小，對(duì)DPPH的清除效果越好，測(cè)試樣品的抗氧化活性越強(qiáng)。DPPH自由基清除率計(jì)算公式為：

1.2.4.2 Rancimat實(shí)驗(yàn)[15]沙棗黃酮的配制：用60%乙醇配制成濃度為50、100、150、200、250mg/L的溶液備用。用油脂氧化儀在溫度為100℃、空氣流量20L/h下測(cè)定誘導(dǎo)時(shí)間。誘導(dǎo)時(shí)間越長(zhǎng)，表明樣品的抗油脂氧化穩(wěn)定性越好，其抗氧化活性越強(qiáng)。

1.2.5 沙棗黃酮抑菌活性研究 抑菌實(shí)驗(yàn)采用濾紙片法[16-17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)黃酮提取效果的影響 用60%乙醇溶液，在超聲功率200W，超聲提取10min，研究料液比對(duì)沙棗黃酮提取效果的影響。由圖1可知，隨料液比的增大，沙棗黃酮得率逐漸增大，當(dāng)料液比達(dá)1∶18時(shí)，黃酮得率為4.82%，隨后料液比繼續(xù)增大，黃酮得率基本保持不變，考慮成本，取黃酮提取的最佳料液比為1∶18。

圖1 料液比對(duì)黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ratio of materiel to solvent on flavonoids extraction

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取效果的影響 在乙醇濃度60%、超聲功率200W，提取料液比為1∶18條件下研究超聲時(shí)間對(duì)沙棗黃酮提取效果的影響。由圖2可知，在0～10min，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，沙棗黃酮得率升高，當(dāng)超聲時(shí)間在10～15min時(shí)，沙棗黃酮得率上升幅度較小，此后，黃酮得率下降，考慮到經(jīng)濟(jì)成本，取10min為最優(yōu)超聲時(shí)間。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on flavonoids extraction

2.1.3 乙醇濃度對(duì)黃酮提取得率的影響 在超聲功率200W、超聲時(shí)間10min，提取料液比為1∶18條件下研究乙醇濃度對(duì)沙棗黃酮得率的影響。由圖3可知，在乙醇濃度為30%～60%時(shí)，隨乙醇濃度增大，黃酮得率增大，當(dāng)乙醇濃度達(dá)60%，沙棗黃酮的提取效果最好，得率達(dá)5.15%，因此選擇60%乙醇為沙棗黃酮最佳提取濃度。

圖3 乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on flavonoids extraction

2.1.4 超聲功率對(duì)黃酮提取率的影響 在超聲時(shí)間10min，料液比為1∶18，乙醇濃度60%的條件下研究超聲功率對(duì)沙棗黃酮提取效果的影響。由圖4可知，在200～320W范圍內(nèi)，隨功率增大，黃酮得率增大，當(dāng)功率達(dá)320W時(shí)，黃酮得率達(dá)5.27%。功率繼續(xù)增大，黃酮含量降低，故提取的最佳超聲功率為320W。

圖4 超聲功率對(duì)黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on flavonoids extraction

2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2中的極差R值可知，四因素對(duì)沙棗黃酮得率的影響程度大小依次為：料液比＞乙醇濃度＞超聲功率＞超聲時(shí)間，因素的最佳組合為A2B2C2D2，即料液比1∶18、超聲時(shí)間10min，乙醇濃度60%，超聲功率320W，在此工藝條件下，黃酮得率為5.28%。方差分析結(jié)果表明：料液比、超聲時(shí)間、乙醇濃度、超聲功率四個(gè)因素對(duì)黃酮得率均有顯著影響（p＜0.05）。

2.3 抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 沙棗黃酮樣品的制備 測(cè)得NKA-9大孔樹(shù)脂純化后的沙棗黃酮得率為77%，用于抗氧化活性與抑菌活性的測(cè)定。

2.3.2 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn) 從圖5可以看出，隨濃度的增大，沙棗黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力增強(qiáng)，在相同濃度下，沙棗黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率高于VC。表4顯示，沙棗黃酮的IC50值小于VC的IC50值，說(shuō)明沙棗黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力強(qiáng)于VC。由此可知，沙棗黃酮的抗氧化活性強(qiáng)于VC。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

圖5 沙棗黃酮對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig.5 DPPH·scavenging activity of flavonoids

表4 沙棗黃酮和VC對(duì)DPPH的IC50值比較Table 4 Comparison of IC50of flavonoids and VC

2.3.3 Rancimat實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由圖6可知，隨濃度增大，沙棗黃酮的抗油脂氧化能力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)濃度為150mg/mL時(shí)，沙棗黃酮的抗油脂氧化能力最強(qiáng)。由表5可知，在此濃度下，沙棗黃酮抗油脂氧化能力強(qiáng)于VC。

2.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

圖6 沙棗黃酮對(duì)油脂抗氧化能力的影響Fig.6 Effects of lard oil of flavonoids on the oxidative stability

表5 沙棗黃酮與VC抗油脂氧化的誘導(dǎo)時(shí)間Table 5 Comparison of induction time of flavonoids and VC

由表6可以看出，沙棗黃酮對(duì)六種供試菌均有抑制作用，但抑制效果與濃度的依賴關(guān)系不明顯。黃酮對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為1.0g/L；對(duì)枯草芽孢桿菌、青霉、毛霉、曲霉的最小抑菌濃度為1.5g/L。

表6 沙棗黃酮的抑菌圈直徑（cm）Table 6 Diameter of antibacterial circle of flavonoids（cm）

3 結(jié)論

沙棗黃酮的最佳提取工藝條件為：料液比1∶18、超聲時(shí)間10min，乙醇濃度60%，超聲功率320W。在此工藝條件下，黃酮得率為5.28%。各因素對(duì)黃酮得率影響的主次順序?yàn)椋毫弦罕龋疽掖紳舛龋境暪β剩境晻r(shí)間；對(duì)DPPH自由基清除效果與Rancimat實(shí)驗(yàn)表明，沙棗黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性；且在同一濃度下，沙棗黃酮的抗氧化能力強(qiáng)于VC；沙棗黃酮對(duì)六種供試菌種都有一定的抑制效果，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為1.0g/L；對(duì)枯草芽孢桿菌、青霉、毛霉、黑曲霉的最小抑菌濃度為1.5g/L。

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