小克銀漢霉高產(chǎn)γ亞麻酸培養(yǎng)基條件優(yōu)化

張 建，萬紅貴，熊 洋，朱 超

（南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211816）

γ亞麻酸（Gamma linoleic acids，GLA），分子式C18H30O2，分子量為278，不溶于水，易溶于正己烷、乙醚、石油醚等有機溶劑，為全順式6，9，12-十八碳三烯酸，ω-6系列多不飽和脂肪酸，在分子結構上有3個共軛雙鍵，所以在空氣中不穩(wěn)定，容易發(fā)生氧化反應。此外，在堿性條件下易發(fā)生異構化反應，形成共軛多烯酸。GLA是組成人體各組織生物膜的結構材料，也是合成前列腺素和白細胞介素的前體物質，是人體內的必需脂肪酸，在有機體的生理代謝和物質調控上發(fā)揮著重要作用，研究表明，GLA能降低血液中總膽固醇含量，起到降血脂的作用[1-3]，是目前報道的治療高血脂癥療效較佳、安全性最高的藥物。GLA還具有調節(jié)免疫系統(tǒng)、抗癌、抗炎癥的作用，可作為肝硬化、風濕性關節(jié)炎、月經(jīng)期乳房痛、過敏性濕疹、精神疾病、糖尿病并發(fā)癥等病癥的治療劑，延長胰腺癌患者的壽命[4]，對緩解更年期綜合征有一定療效[5]。由于GLA廣泛的生理活性和明顯的藥理作用，因此被認為是“21世紀功能性食品主角”[6]。GLA主要存在于某些種子植物、孢子植物的油中，例如柳葉科月見草（Oenothera biennis），紫草科玻璃苣（borage）和黑醋粟（R.Nigrum）的油脂中均含有GLA。但自然界中GLA的資源極其有限，并且植物易受環(huán)境氣候、地域、季節(jié)的影響，產(chǎn)量和質量不穩(wěn)定，根本不能滿足市場的需求，后經(jīng)大量的研究發(fā)現(xiàn)，某些微生物在一定條件下能將碳水化合物、碳氫化合物等轉化為油脂貯存在菌體內，因此開創(chuàng)了微生物發(fā)酵產(chǎn)GLA的時代。GLA的微生物來源主要是微藻和真菌，如螺旋藻屬（Spirulina）的極大螺旋藻（Spirulinamaxima）、節(jié)螺藻屬（Arthrospira）、蘭絲藻（Spirulinaplatensis）、小球藻（Chlorella）[7-8]和毛霉屬的球胞毛霉（Mucorg loborus）、微小毛霉（Mlpusillus）、魯西毛霉（Mucor rouxii）以及孢霉屬、根霉屬（Rhizopus）[9]、小克銀漢霉屬（Cunninghamella）等。本文主要以小克銀漢霉菌為研究對象，通過正交實驗優(yōu)化策略，獲得適合小克銀漢霉菌發(fā)酵產(chǎn)GLA的合成培養(yǎng)基，為GLA的大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小克銀漢霉菌（Cunninghamella elegans）南京工業(yè)大學國家生化工程技術研究中心發(fā)酵代謝工程實驗室保藏；牛肉膏、蛋白胨 購自國藥集團化學試劑有限公司；酵母膏 購自安琪酵母股份有限公司；其他試劑 國產(chǎn)分析純試劑；斜面保藏培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基（g/L）葡萄糖50，牛肉膏0.1，（NH4）2SO40.1，KH2PO43，MgSO4·7H2O 0.5，pH6.5，115℃滅菌30min；初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）葡萄糖100，酵母膏1，（NH4）2SO41，KH2PO43，MgSO4·7H2O 0.5，pH6.5，115℃滅菌30min。

LG10-2.4A型高速離心機 北京醫(yī)用離心機廠；BS224S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；GZX-9140MBE型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；PHS-3C型精密pH計上海精密科學儀器有限公司；LDZX-40自動型系列立式自動壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；GC112A-1型氣相色譜儀 上海舜宇恒平科技有限公司；色譜柱 DB-FFAP（30m×0.32mm×0.25μm）Agilent。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng) 用10mL無菌水將生長良好的斜面菌種洗脫，接種到種子培養(yǎng)基中，置于28℃、220r/min搖床上培養(yǎng)2d，然后以15%接種量接種至裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在28℃、220r/min搖床上培養(yǎng)4～6d。

1.2.2 菌絲干重的測定 發(fā)酵液用四層紗布過濾，得到的菌體用清水洗滌三次，多余的水分用真空泵抽干，然后在80℃烘箱中干燥至恒重，稱量。

1.2.3 油脂提取 索氏提取法提取粗菌油[10]。

1.2.4 γ亞麻酸的測定[11]混合脂肪酸甲酯的制備：取油脂0.1g（或干菌體0.2g）置于10mL容量瓶中，加入5%KOH-CH3OH溶液（質量體積比）1mL，60℃水浴10min。取出容量瓶，室溫冷卻5min，加入甲醇2mL，三氟化硼-乙醚溶液1.5mL，充分振蕩混勻，60℃水浴10min。取出容量瓶，室溫冷卻5min，加入正己烷2mL，充分振蕩混勻，靜置10min。取上層清液0.1mL置于1.5mL離心管中加入0.5mL正己烷，再加入少許無水Na2SO4（用于吸水），取1μL進樣。

色譜條件：DB-FFAP毛細管柱（30m×0.32mm×0.25μm）；檢測器為氫離子火焰檢測器（FID）；載氣為N2，載氣流速1mL/min，分流比60∶1；進樣口溫度250℃；檢測口溫度230℃；柱前壓0.08MPa；柱溫200℃；進樣量1μL。

1.2.5 碳源對γ亞麻酸產(chǎn)量的影響 改變初始發(fā)酵培養(yǎng)基里的碳源，分別以100g/L的葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖考察不同的碳源對GLA產(chǎn)量、生物量的影響。

1.2.6 葡萄糖添加量對γ亞麻酸發(fā)酵的影響 分別以40、60、80、100、120、140g/L的葡萄糖濃度梯度加入到初始發(fā)酵培養(yǎng)基里考察對GLA產(chǎn)量、生物量的影響。

1.2.7 氮源對γ亞麻酸產(chǎn)量的影響 改變初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，分別以3g/L的無機氮源（NH4）2SO4、NH4Cl、NaNO3、KNO3和有機氮源尿素、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、麥芽浸粉9種氮源考察不同類型氮源對GLA產(chǎn)量、生物量的影響。

1.2.8 氮源濃度對γ亞麻酸產(chǎn)量的影響 將不同濃度梯度的無機氮源和有機氮源添加到初始培養(yǎng)基中考察對GLA產(chǎn)量、生物量的影響。

1.2.9 磷酸鹽對γ亞麻酸產(chǎn)量的影響 以不同濃度梯度的K2HPO4、KH2PO4、K2HPO4-KH2PO4加入到初始培養(yǎng)基里考察對GLA產(chǎn)量的影響。

1.2.10 無機鹽離子對γ亞麻酸產(chǎn)量的影響 分別以不同濃度梯度的Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+添加到初始培養(yǎng)基里以考察這幾種離子對GLA產(chǎn)量的影響。

1.2.11 正交實驗采用L18（37）正交表（表1）對葡萄糖、尿素、NaNO3、Mg2+、Fe2+、Ca2+、K2HPO4濃度進行優(yōu)化實驗，以確定最優(yōu)的培養(yǎng)基。

2 結果與討論

2.1 碳源對γ亞麻酸產(chǎn)量的影響

圖1 不同碳源對GLA產(chǎn)量及生物量的影響Fig.1 Effect of various carbon sources on GLA and biomass production

碳源對GLA產(chǎn)量的影響實驗結果如圖1所示。葡萄糖作為碳源時，葡萄糖產(chǎn)GLA的含量最高，達到0.98g/L；其次是可溶性淀粉，GLA產(chǎn)量達到0.78g/L；蔗糖、乳糖、半乳糖和果糖的GLA產(chǎn)量相對較低。從菌體生物量上看，葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉作為碳源時都有利于菌體生物量的增加，生物量都在16g/L以上，但蔗糖、可溶性淀粉與葡萄糖相比GLA產(chǎn)量偏低。故不管是在生物量上還是GLA產(chǎn)量上葡萄糖在發(fā)酵生產(chǎn)中的效果普遍優(yōu)于其他碳源，因此選用葡萄糖為發(fā)酵最適碳源。

表1 正交實驗表Table 1 The orthogonal experimental design

2.2 葡萄糖添加量對γ亞麻酸發(fā)酵的影響

葡萄糖作為碳源為菌體生長和GLA的產(chǎn)出提供能量，作為發(fā)酵培養(yǎng)基中一個重要成分，其濃度對發(fā)酵過程有很大影響。

實驗考察了葡萄糖質量濃度對GLA發(fā)酵的影響，結果如圖2所示。由圖2可以看出，在發(fā)酵體系里，當葡萄糖的濃度為40、60、80、100、120、140g/L時，生物量分別為17.5、18.5、19.8、20.7、19.6、18.7g/L，即隨著葡萄糖濃度的升高，生物量變化不大。隨著葡萄糖濃度的增大，GLA的產(chǎn)量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是低濃度葡萄糖不利于GLA合成，高濃度的葡萄糖由于“底物效應”抑制了GLA合成。當葡萄糖濃度達到100g/L時生物量和GLA產(chǎn)量最高，故選擇100g/L葡萄糖濃度作為碳源最佳濃度。

圖2 不同濃度的葡萄糖對GLA產(chǎn)量及生物量的影響Fig.2 Effect of various Glucose concentration on GLA and biomass production

2.3 氮源對γ亞麻酸產(chǎn)量的影響

以100g/L葡萄糖作為碳源，改變初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，考察其對GLA產(chǎn)量的影響，實驗結果如圖3、圖4所示。

由圖3可知，有機氮源中，以尿素作為氮源菌體生物量達到23.4g/L，GLA產(chǎn)量達到1.42g/L，明顯優(yōu)于其他有機氮源。

由圖4可知，以NaNO3和KNO3作為氮源時，菌體生物量較高，分別達到19.2g/L和19.5g/L，GLA產(chǎn)量分別1.23g/L和0.98g/L，而以（NH4）2SO4、NH4Cl作為氮源時，菌體生物量和GLA產(chǎn)量均不及前兩者。綜合考慮選擇NaNO3為最佳無機氮源。NaNO3作為氮源菌體生物量和GLA產(chǎn)量較高的原因可能是，NaNO3在提供氮源的同時還提供Na+，Na+參與代謝，具有維持酸堿平衡的作用。

圖3 有機氮源對GLA產(chǎn)量和生物量的影響Fig.3 Effect of organic nitrogen on GLA and biomass production

圖4 無機氮源對GLA產(chǎn)量和生物量的影響Fig.4 Effect of inorganic nitrogen on GLA and biomass production

所以在發(fā)酵生產(chǎn)中選取有機氮源尿素和無機氮源NaNO3，作為最佳氮源進行優(yōu)化。

2.4 不同NaNO3和尿素濃度的單因素實驗

氮源濃度對GLA的產(chǎn)量實驗結果見圖5、圖6。氮源在微生物產(chǎn)油脂發(fā)酵中主要作為限制因素，由圖5可以看出，尿素在為菌體生長提供充足的氮源的同時也會產(chǎn)生抑制作用，所以在發(fā)酵體系中隨著尿素濃度的升高，GLA產(chǎn)量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當尿素濃度在0.4%時，菌體生物量和GLA產(chǎn)量均達到最高。

圖5 不同濃度尿素和NaNO3對GLA產(chǎn)量和生物量的影響Fig.5 Effect of different concentrations of urea and sodium nitrate on GLA and biomass production

圖6 復合氮源對GLA產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of composite nitrogen source on GLA production

隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵液中酸性物質增多，pH降低，酸性環(huán)境不利于菌體的生長，NaNO3作為一種生理堿性鹽，在一定程度上起到了發(fā)酵體系pH緩沖劑的作用，所以在NaNO3濃度為0.5%時，GLA產(chǎn)量達到1.44g/L。但僅以NaNO3作為氮源，生物量較少且NaNO3濃度進一步提高會造成發(fā)酵體系中C/N失衡，不利于GLA產(chǎn)量增加。綜合考慮，選取尿素為主氮源，以NaNO3為輔助氮源做進一步研究。

為提高菌體生物量和GLA產(chǎn)量，采取氮源復配方式，按比例添加無機氮源和有機氮源。將0.4%的尿素作為主氮源，分別添加0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%濃度下的NaNO3。由圖6看出，將尿素與NaNO3復配時，尿素濃度為0.4%，NaNO3濃度為0.2%時，菌體生物量達到30.2g/L，GLA產(chǎn)量達到1.72g/L，較復配前有了顯著提高。

2.5 磷酸鹽對γ亞麻酸產(chǎn)量的影響

由圖7可以看出，適量的K2HPO4對GLA產(chǎn)量有顯著的促進作用，而隨著濃度的增加，KH2PO4對GLA產(chǎn)量表現(xiàn)為抑制作用，K2HPO4-KH2PO4對GLA產(chǎn)量的影響不及K2HPO4。磷酸鹽作為緩沖液對調節(jié)培養(yǎng)基的pH有重要作用，這些現(xiàn)象也說明GLA的合成可能和培養(yǎng)基的pH有重要關聯(lián)。而磷對能量代謝、糖代謝、核酸和脂有重要影響，但是過高的磷含量可能會抑制代謝通路里某些關鍵酶活力或者酶的合成[12]，最終會表現(xiàn)為GLA產(chǎn)量的降低。最終選取K2HPO4作為磷酸鹽加以研究。

圖7 磷酸鹽對GLA產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of phosphate on GLA production

2.6 無機鹽離子以及濃度對GLA產(chǎn)量的影響

圖8 金屬離子對GLA產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of ions on GLA production

無機鹽或者金屬離子可以作為多種酶的輔酶，它們對許多激酶和合成酶具有激活作用并且能維持細胞和生物體的酸堿平衡。分別以Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+作為無機鹽進行篩選，由圖8可知，Ca2+、Mg2+、Fe2+對GLA產(chǎn)量的促進作用較大。Mg2+一般是微生物代謝路徑里多種酶的激活劑，能促進糖代謝進程。小克銀漢霉是好氧菌，F(xiàn)e2+可能參與了呼吸鏈進程，進而影響了整個能量代謝過程，此外，細胞內的鈣調節(jié)蛋白與Ca2+結合，形成的一種復合物，可激活體內多種酶的活性。由此選取Mg2+、Fe2+、Ca2+做進一步研究。

2.7 正交實驗

采用L18（37）正交表對葡萄糖、尿素、NaNO3、Mg2+、Fe2+、Ca2+、K2HPO4濃度進行優(yōu)化實驗，以確定最優(yōu)的培養(yǎng)基，結果見表2、表3。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal experimental

表3 培養(yǎng)基方差分析表Table 3 Analysis results of variance

由正交實驗數(shù)據(jù)可以看出，各因素對GLA產(chǎn)量的影響順序為：D＞E＞A＞C＞F＞G＞B，其中A、C、E對GLA產(chǎn)量影響顯著，D極顯著；最佳組合為：A2B1C1D1E2F2G3，即葡萄糖100g/L，尿素3g/L，NaNO33g/L，Mg2+0.1g/L，F(xiàn)e2+0.04g/L，Ca2+0.04g/L，K2HPO41.5g/L。經(jīng)多次重復實驗驗證后，小克銀漢霉產(chǎn)GLA高達3.34g/L，高于表2中其他組的GLA產(chǎn)量。

3 結論

通過單因素和正交實驗確定了小克銀漢霉的高產(chǎn)GLA的最佳培養(yǎng)基組成為葡萄糖100g/L，尿素3g/L，NaNO33g/L，Mg2+0.1g/L，F(xiàn)e2+0.04g/L，Ca2+0.04g/L，K2HPO41.5g/L。在此培養(yǎng)基基礎上GLA產(chǎn)量達到3.34g/L，是初始發(fā)酵培養(yǎng)基GLA產(chǎn)量（0.74g/L）的4.5倍。

[1]Laidlaw M，Holub B J.Effects of supplementation with fish oil derived n-3 fatty acids and γ-linolenic acid on circulating plasma lipids and fatty acid profiles in women[J].American Journal of Clinical Nutrition，2003，77（1）：37-42.

[2]Guivernau M，Meza N，Barja P，et al.Clinical and experimental study on the long-term effect of dietary gamma-linolenic acid on plasma lipids，platelet aggregation，thromboxane formation，and prostacyclin production[J].Prostaglandins，Leukotrienes and Essential Fatty Acids，1994，51（5）：311-316.

[3]FanY Y，Ramos K S，Chapkin R S.Dietary gamma linolenic acid enhances mouse macrophage derived prostaglandin E1which inhibits vascular smooth muscle cell proliferation[J].The Journal of Nutrition，1997，127（9）：1765-1771.

[4]Fearon K C H，J S Falconer，J A Ross，et al.An Open-Label Phase I/II DoseEscalation Study of the Treatment of Pancreatic Cancer Using Lithium Gammalinolenate[J].Anticancer Res，1996，16：867-874.

[5]董杰明，吳瑞華，袁昌魯，等.γ-亞麻酸的保健作用[J].衛(wèi)生研究，2003，3（3）：299-301.

[6]田歆珍，王賢磊，孫桂琳，等.γ-亞麻酸的研究進展[J].生物技術，2008，18（1）：89-92.

[7]Choi G G，Bae M S，Ahn C Y.Enhanced biomass and gamma linolenic acid production of mutant strain Arthrospira platensis[J].Micr obial Biotechnol，2008，18（3）：539-544.

[8]Jeennor S， Laoteng K， Tanticharoen， et al.Evaluation of inoculum performance for enhancing gamma linolenic acid product ion from Mucor rouxii[J].Lett Appl Microbiol，2008，46（4）：421-427.

[9]Tauk-Tornisielo S M， Arasato L S， De Almeida A F， et al.Lipid formation and gamma-linolenic acid production by Mucor circinelloides and Rhizopus sp.grown on vegetable oil[J].Brazilian Journal of Microbiology，2009，40（2）：342-345.

[10]M Zhu，P P Zhou，L J Yu.Extraction of lipids from Mortierella alpine and enrichment of arachidonic acid from the fungal lipids[J].Bioresource Technology，2002，84：93-95.

[11]Katan MB，Zock PL，Mensink R P.Trans fatty acids and their effects on lipoproteins in humans[J].Annual Reviews of Nutrition，1995（15）：473-493.

[12]盧崢嶸，趙萌，沐萬孟，等.發(fā)酵產(chǎn)菊糖果糖轉移酶的培養(yǎng)基設計及菌體生長動力學研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（9）：19-23.