紫蘇乳狀液酶解破乳工藝的研究

張雅娜，李 楊，2，江連洲，2，*，王 妍，張 妍，馮紅霞，隋曉楠

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江省哈爾濱150030）

紫蘇（perilla frutescens（Linn.）britton），別名：赤蘇、紅蘇、黑蘇、紅紫蘇、皺紫蘇等，其種子稱為蘇子，其葉稱為蘇葉，屬桃金娘科蒲桃屬，系唇形科（Labiate）一年生草本植物，原產(chǎn)于中國(guó)，廣泛分布在中國(guó)、日本、韓國(guó)、越南、土耳其和美國(guó)[1]。紫蘇籽是一種獨(dú)特的保健油料作物，從紫蘇籽中提取的紫蘇油含有豐富的α-亞麻酸，含量可達(dá)56.1%～64.8%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他植物油[2]，近年來(lái)備受?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者矚目。水酶法是一種新的油脂提取技術(shù)，它具有作用條件溫和、避免使用有機(jī)溶劑等優(yōu)勢(shì)[3]。但目前很多研究表明，在酶解過(guò)程中會(huì)形成穩(wěn)定的乳化體系，是由于在乳狀液中大部分油脂和蛋白緊密結(jié)合[4]，阻礙油脂釋放[5-6]，降低油脂提取率，因此，打破乳狀液的穩(wěn)定性，使油脂能夠充分的釋放出來(lái)，已經(jīng)成為水酶法在提油工藝中的瓶頸問(wèn)題。目前已有越來(lái)越多的研究集中到破乳工藝上[7-9]。其常用破乳方法有：轉(zhuǎn)相法[10-11]、加熱法[12-13]、冷凍解凍法[12，14-17]、酶法[18]、調(diào)整pH法[19-21]、剪切法[22-23]等。目前酶解破乳已應(yīng)用在大豆水酶法提油過(guò)程中[24-25]，應(yīng)用酶法進(jìn)行破乳能夠盡量減少乳狀液的穩(wěn)定性，從而提高油的回收率。本實(shí)驗(yàn)對(duì)紫蘇水酶法過(guò)程中形成乳狀液的酶解破乳工藝進(jìn)行研究，應(yīng)用不同酶（Protex 6L、Protex 7L、Alcalase 2.4L）對(duì)乳狀液進(jìn)行破乳，首先對(duì)酶種類進(jìn)行選擇，選出最佳酶，并在單因素的基礎(chǔ)上選擇出最佳酶解破乳參數(shù)，再利用響應(yīng)面法對(duì)紫蘇乳狀液酶法破乳工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫蘇 產(chǎn)自長(zhǎng)白山；Cellulase 丹麥諾維信公司；Alcalase 2.4L 丹麥諾維信公司；Protex 6L、7L 無(wú)錫杰能科生物工程有限公司；Viscozyme L 丹麥諾維信公司；乙醚、石油醚、乙醇、正己烷 北京昊科爾化工有限公司；氫氧化鈉 宜興市輝煌化學(xué)試劑廠，分析純；其他試劑 均為分析純。

JY-9211N超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；JE-502電子天平 上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；MJ-60BE01B美的料理機(jī) 廣東美的精品電器制造有限公司；HH-4丹瑞數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠；PHS-25C數(shù)字酸度計(jì)上海大普儀器有限公司；LGR20-W臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；BGZ-246電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BCD-215cm美的冰箱 合肥美的榮事達(dá)電冰箱有限公司；KDN-103F自動(dòng)定氮儀、HYP-1040四十孔消化爐 上海纖檢儀器有限公司；SCT-02索氏抽提器 天津玻璃儀器廠；SX-4-10箱式電阻爐 天津市泰斯特儀器有限公司；Agillent 6890-5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)工藝流程見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)工藝流程Fig.1 Experimental procedure flow

1.2.1 紫蘇主要成分的測(cè)定 水分的測(cè)定：根據(jù)GB304-87進(jìn)行測(cè)定；粗脂肪的測(cè)定：根據(jù)GB5512-85中索氏抽提法進(jìn)行測(cè)定；粗蛋白的測(cè)定：根據(jù)GB6432-94進(jìn)行；灰分測(cè)定：根據(jù)GB5009.4-85進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 紫蘇籽脫殼處理 紫蘇籽用脫殼機(jī)進(jìn)行脫殼

式中，乳狀液含油量測(cè)定方法參照1990-AOAC Method，AOAC 955.19[27]。

1.2.7 二次酶解破乳的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1 pH對(duì)二次酶解破乳油脂回收率的影響 實(shí)驗(yàn)選擇在Protex-6L堿性蛋白酶的工作pH范圍內(nèi)（pH=8～10）。在溫度60℃，酶添加量2%（乳狀液質(zhì)量的2%），酶解1h，乳狀液/水=1∶20（w/v）的條件下，分別考察了pH為8.0、8.5、9.0、9.5和10.0對(duì)酶解紫蘇乳狀液的影響，并測(cè)其油脂回收率。

1.2.7.2 酶解溫度對(duì)二次酶解破乳油脂回收率的影響 實(shí)驗(yàn)選擇Protex-6L堿性蛋白酶的工作溫度范圍（50～70℃）。在pH=9.5、酶添加量2%（乳狀液質(zhì)量的2%）、酶解1h、乳狀液/水=1∶20（w/v）的條件下，分別考察了溫度在50、55、60、65和70℃對(duì)酶解紫蘇乳狀液的影響，并測(cè)其油脂回收率。

1.2.7.3 加酶量對(duì)二次酶解破乳油脂回收率的影響實(shí)驗(yàn)選擇酶添加量范圍為1%～3%。在pH=9.5、酶解溫度60℃、酶解1h、乳狀液/水=1∶20（w/v）的條件下，分別考察了底物濃度在1%、1.5%、2%、2.5%和3%時(shí)對(duì)酶解紫蘇乳狀液的影響，并測(cè)其油脂回收率。

1.2.7.4 酶解時(shí)間對(duì)二次酶解破乳油脂回收率的影處理，利用風(fēng)機(jī)將殼除去，脫殼后的紫蘇籽立即用于提取實(shí)驗(yàn)或放入兩層的封口袋中密封并儲(chǔ)存在4℃的冰箱中，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 粉碎處理 準(zhǔn)確稱取30g脫殼清理后的紫蘇籽，料理機(jī)干磨Ⅱ檔粉碎15s，用180mL的蒸餾水沖洗三次攪拌杯內(nèi)壁，要求攪拌杯內(nèi)壁沖洗完全干凈，然后倒入500mL燒杯中，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 超聲預(yù)處理 將步驟1.2.3中裝有紫蘇料的燒杯放入超聲波細(xì)胞破碎儀中進(jìn)行超聲處理，條件為：時(shí)間20min，功率400W，溫度40℃。超聲處理后的紫蘇籽進(jìn)行下一步水酶法酶解實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 水酶法乳狀液的制備 如圖1所示。超聲預(yù)處理后，將裝有紫蘇料的500mL燒杯置于60℃的水浴鍋中，用2mol/L的HCl溶液/NaOH溶液調(diào)整pH5.0，加入3%（紫蘇籽質(zhì)量的3%）的Cellulase酶，攪拌3h以進(jìn)行酶解。酶解結(jié)束后進(jìn)行離心操作（10000r/min、20℃、40min），離心后分為四層（游離油、乳狀液、水解液、殘?jiān)?，最上層游離油用正己烷萃取，用蒸氣浴揮發(fā)充分后進(jìn)行稱量計(jì)數(shù)，剩余的乳狀液和水解液倒入500mL分液漏斗中，4℃下靜止12h，分離出乳狀液置于已稱重的燒杯中，用于進(jìn)一步破乳實(shí)驗(yàn)[26]。

1.2.6 酶破乳處理的方法 圖1顯示了二次酶解破乳處理的破乳條件（酶的種類、加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH、料液比w/v）及后續(xù)步驟，其中，pH為每一種酶的最佳pH，由廠家說(shuō)明書(shū)指定。每次破乳實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次?？瞻滋幚聿惶砑用?，其余與三種酶法破乳的條件一致，破乳處理后，樣品轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，20℃10000r/min下離心40min，離心后，通過(guò)巴斯德吸管吸取上層游離油，剩下的殘留在乳狀液表面的游離油用正己烷洗滌、蒸氣浴揮發(fā)后準(zhǔn)確稱量油重，并計(jì)算油脂回收率。油脂回收率計(jì)算公式如下：響 實(shí)驗(yàn)在pH=9.5、酶解溫度60℃、酶添加量2%（乳狀液質(zhì)量的2%）、乳狀液/水=1∶20（w/v）的條件下，分別酶解0.5、1、1.5、2、2.5h，考察酶解時(shí)間對(duì)酶解紫蘇乳狀液的影響，并測(cè)其油脂回收率。

1.2.8 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 以單因素為基礎(chǔ)，利用Design Expert 7.1.1軟件，采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)二次酶解破乳酶解參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。表1為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Box-Behnken experimental design

1.2.9 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析 乳狀液的提取和對(duì)乳狀液的每步處理均獨(dú)立操作三次。因此，所有油脂回收率的計(jì)算都是3個(gè)數(shù)的平均數(shù)。實(shí)驗(yàn)以單因素為基礎(chǔ)，利用Design Expert 7.1.1軟件設(shè)計(jì)，進(jìn)一步對(duì)二次酶解破乳酶解參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.10 紫蘇油脂肪酸分析方法

1.2.1 0.1 紫蘇籽脂肪酸甲酯的制備 稱取油脂或脂肪酸50mg置于10mL量瓶?jī)?nèi)，加入3mL正己烷和苯的混合溶劑（1∶1）輕輕搖動(dòng)使之溶解。再加入2mL 0.5mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，混勻。在室溫靜置30min，加蒸餾水使全部有機(jī)相甲酯溶液升至瓶頸上部。澄清后吸取上清液，所得清液即可用于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

1.2.1 0.2 GC-MS分析條件 色譜條件：色譜柱為HP-88（100m×0.25mm×0.20μm）彈性石英毛細(xì)管柱；載氣為He氣；載氣流量為1mL/min；進(jìn)樣口溫度為250℃；初始溫度80℃，保持5min，以10℃/min升溫到150℃，保持2min，再以5℃/min升溫至230℃，保持10min，總分析時(shí)間為40min，進(jìn)樣模式為split，分流比30∶1，進(jìn)樣量0.2μL。

質(zhì)譜條件：電離方式EI，電子能量70eV，四級(jí)桿溫度為150℃，離子源溫度230℃，傳輸線溫度為250℃，質(zhì)譜掃描范圍50～550amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇籽的主要成分及乳狀液中的油脂含量

參照AOAC 955.19方法測(cè)得紫蘇乳狀液中油脂含量為39.96%。本實(shí)驗(yàn)材料紫蘇籽的主要成分如表2所示。

表2 紫蘇籽的主要成分Table 2 Main components of the perilla frutescens seeds

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同酶的破乳處理 由圖2可知，用Protex 6L進(jìn)行二次酶解破乳，得到油脂回收率為69.56%，破乳效果最好；而空白實(shí)驗(yàn)組的油脂回收率為30.91%，破乳效果最差；Alcalase 2.4L和Protex 7L破乳效果處于兩者之間。不加酶的油脂回收率低于添加酶的油脂回收率，結(jié)果表明蛋白酶能夠破壞紫蘇乳狀液的穩(wěn)定性，對(duì)油脂的回收具有重要意義。因此，選擇Protex 6L進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同酶二次酶解破乳油脂的回收率Fig.2 The econdary hydrolysis de-emulsification oil recovery yield of different enzyme

2.2.2 pH對(duì)二次酶解破乳油脂回收率的影響 由圖3可知，當(dāng)pH小于9.5時(shí)，隨著pH的增加，油脂回收率逐漸增加；當(dāng)pH為9.5時(shí)，油脂回收率最高，為75.56%；pH在9.5以后，油脂回收率反而降低；當(dāng)pH為10時(shí)，油脂回收率最低。因此，最適酶解pH為9.5。主要原因是Protex 6L的最適pH接近9.5，pH在9.5附近時(shí)酶活高，酶對(duì)底物作用效果明顯，油脂回收率最高。

圖3 不同pH對(duì)二次酶解破乳油脂回收率的影響Fig.3 Effect of pH on the econdary hydrolysis de-emulsification oil recovery yield

2.2.3 酶解溫度對(duì)二次酶解破乳油脂回收率的影響由圖4可知，隨著溫度的升高，油脂回收率增加，當(dāng)溫度為60℃時(shí)，油脂回收率最高，而后隨著溫度的升高，油脂回收率反而逐漸降低。因?yàn)闇囟瘸^(guò)了Protex6L的最適溫度，導(dǎo)致酶活性降低，同時(shí)溫度過(guò)高會(huì)使酶變性，使酶的活性中心結(jié)構(gòu)受到破壞，部分或全部失去催化活性[28]。因此，最適的酶解溫度為60℃。

2.2.4 加酶量對(duì)二次酶解破乳油脂回收率的影響由圖5可知，隨著加酶量的增加，油脂回收率顯著上升，添加量達(dá)到2%時(shí)，油脂回收率最大；當(dāng)添加量超過(guò)2%后，油脂回收率變化不明顯，趨于穩(wěn)定。主要原因是酶添加量增加，使酶與底物可以充分接觸，酶能夠滲透到脂質(zhì)體膜內(nèi)，并且酶對(duì)脂蛋白的分解作用有利于油脂從油脂-蛋白的復(fù)合體中釋放出來(lái)[29]?？紤]到經(jīng)濟(jì)效益，油脂回收率幾乎接近的條件下，最佳的加酶量選為2%。

圖4 不同酶解溫度對(duì)二次酶解破乳油脂回收率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the econdary hydrolysis de-emulsification oil recovery yield

圖5 不同加酶量對(duì)二次酶解破乳油脂回收率的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on the econdary hydrolysis de-emulsification oil recovery yield

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)二次酶解破乳油脂回收率的影響由圖6可知，當(dāng)酶解時(shí)間少于1.5h時(shí)，油脂回收率隨酶解時(shí)間增加呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)，變化較明顯；而當(dāng)酶解時(shí)間高于1.5h時(shí)，油脂回收率隨著時(shí)間的增長(zhǎng)反而逐漸降低，但變化較平緩。因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的增加，底物不斷減少，酶解充分，但酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，油脂與空氣長(zhǎng)時(shí)間接觸，會(huì)影響油的品質(zhì)，而且時(shí)間長(zhǎng)能耗相對(duì)較高，從經(jīng)濟(jì)效益的角度考慮酶解時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，因此，綜合考慮最適的酶解時(shí)間為1.5h。

2.3 響應(yīng)面法對(duì)二次酶解破乳工藝條件的優(yōu)化

圖6 不同酶解時(shí)間對(duì)二次酶解破乳油脂回收率的影響Fig.6 Effect of hydrolysis time on the econdary hydrolysis de-emulsification oil recovery yield

運(yùn)用Design Expert 7.1.1統(tǒng)計(jì)分析軟件，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究二次酶解破乳各酶解參數(shù)對(duì)考察指標(biāo)的影響規(guī)律，并得到二次酶解破乳的最佳條件。以二次破乳各酶解工藝參數(shù)pH（x1）、酶解溫度（x2）、加酶量（x3）、酶解時(shí)間（x4）為自變量，以乳狀液中油脂回收率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)了四因素五水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，其因素水平編碼表見(jiàn)表1；響應(yīng)面共設(shè)計(jì)了30個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，包括24個(gè)分析因點(diǎn)和6個(gè)零點(diǎn)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Box-Behnken design and experimental results

2.4 方差分析

通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析軟件Design Expert 7.1.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，對(duì)油脂回收率（y）與pH（x1）、酶解溫度（x2）、加酶量（x3）和酶解時(shí)間（x4）之間建立二次響應(yīng)面回歸模型如下：y=85.04-0.76x1+1.04x2+0.061x3+1.64x4-2.79x1x2-1.07x1x3+2.96x1x4-1.23x2x3+0.45x2x4-2.31x3x4-2.61-2.15-1.20x32-5.70x42。

回歸與方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回歸與方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis of the fitted regression model for oil recovery yield

對(duì)該回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。從表4中可以看出，該模型一次項(xiàng)x4、交互項(xiàng)x1x2、x1x4、x3x4和二次項(xiàng)x12、x22、x32、x42的影響極顯著（p＜0.01），一次項(xiàng)x2、交互項(xiàng)x1x3、x2x3的影響顯著 （p＜0.05），其他項(xiàng)不顯著，表明各因素對(duì)于油脂回收率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。該模型回歸極顯著（p＜0.001），失擬誤差不顯著，并且R2=0.9659，R2Adj=0.9341，說(shuō)明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，實(shí)驗(yàn)誤差小，可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)水酶法提取紫蘇油的結(jié)果。因此，上述二次回歸方程模型是合適的。由F檢驗(yàn)可以得出因子貢獻(xiàn)率為：x4＞x2＞x1＞x3，即酶解時(shí)間＞酶解溫度＞pH＞加酶量。

2.5 響應(yīng)面分析

應(yīng)用響應(yīng)面尋優(yōu)分析方法對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，當(dāng)酶解時(shí)間為1.6h，酶解溫度為62.6℃，pH為9.4，加酶量為1.9%，響應(yīng)面最優(yōu)值為85.524%±0.74%。

圖7為各交互項(xiàng)的響應(yīng)曲面圖。由圖7分析結(jié)果可以看出：pH（x1）與酶解溫度（x2），pH（x1）與加酶量（x3），pH（x1）與酶解時(shí)間（x4），酶解溫度（x2）與加酶量（x3），加酶量（x3）與酶解時(shí)間（x4）的相互作用對(duì)油脂回收率的影響。由此可知，在加酶量為1.0～3.0范圍內(nèi)，加酶量對(duì)油脂回收率的因子貢獻(xiàn)率雖然小，但其與其他因素的交互作用對(duì)油脂回收率影響較大。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

圖7 各交互顯著項(xiàng)對(duì)紫蘇油脂回收率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface of Each significant interaction effect on oil recovery yield of perilla frutescens oil

在酶解時(shí)間為1.6h、酶解溫度為62.6℃、pH為9.4、加酶量為1.9%條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到平均油脂回收率為85.52%。響應(yīng)值的實(shí)驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測(cè)值吻合良好，說(shuō)明該模型能夠較好預(yù)測(cè)實(shí)際紫蘇油提油及破乳情況。

2.7 紫蘇油脂肪酸分析

圖8 紫蘇油氣相色譜圖Fig.8 Gas-phase chromatogram of perilla frutescens oil

表5 紫蘇油中主要的脂肪酸種類及含量Table 5 Main fatty acid compositions and contents of perilla frutescens oil

本實(shí)驗(yàn)得到的紫蘇油呈淡黃色，澄清透明，具有紫蘇獨(dú)特的香味。由圖8及表5可知，對(duì)紫蘇油脂肪酸甲酯進(jìn)行GC-MS分析，根據(jù)GC-MS聯(lián)用儀獲得質(zhì)譜信息經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照，分析了肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生酸7種主要組分，利用面積歸一化法分別對(duì)各種脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行定量，結(jié)果表明，紫蘇油脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：肉豆蔻酸0.46%、棕櫚酸9.38%、硬脂酸6.81%、油酸22.11%、亞油酸12.23%、α-亞麻酸53.10%、花生酸0.52%。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化得出二次酶解破乳的最佳條件為：Protex 6L酶解時(shí)間為1.6h，酶解溫度為62.6℃，pH為9.4，加酶量為1.9%，紫蘇油脂回收率為85.52%。得到的紫蘇油呈淡黃色，澄清透明，具有紫蘇獨(dú)特的香味。提取的紫蘇油經(jīng)脂肪酸分析得到7種脂肪酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：肉豆蔻酸0.46%、棕櫚酸9.38%、硬脂酸6.81%、油酸22.11%、亞油酸12.23%、α-亞麻酸53.10%、花生酸0.52%。

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