油橄欖葉提取物中橄欖苦苷穩(wěn)定性及對(duì)亞鐵離子的螯合作用

謝普軍，黃立新，*，張彩虹，游 鳳，王成章，周 昊

（1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室；國(guó)家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210042；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所，北京100091）

橄欖苦苷是一種屬于裂環(huán)烯醚萜苷類(lèi)特殊單萜化合物，普遍存在于木犀屬、女貞屬、丁香屬等油橄欖樹(shù)的植物組織中[1]。作為油橄欖樹(shù)代表物質(zhì)，學(xué)者對(duì)它的研究頗多。經(jīng)一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，油橄欖樹(shù)的組織中橄欖苦苷含量因不同品種、地區(qū)和時(shí)間而不同[2]，與油橄欖樹(shù)的其他組織相比，油橄欖樹(shù)葉的含量最高[3]。從1908年至今，從橄欖油里發(fā)現(xiàn)具有苦澀味的物質(zhì)橄欖苦苷[4]，經(jīng)過(guò)100多年的研究發(fā)現(xiàn)橄欖苦苷具有多種藥理生物活性，如抗炎、抗各種微生物、抗氧化、抗腫瘤、抗癌和降血糖[5-10]等。橄欖苦苷的諸多活性使其在食品、藥品和化妝品方面應(yīng)用十分廣泛[11]，現(xiàn)已有橄欖苦苷的相關(guān)產(chǎn)品問(wèn)世。另外研究學(xué)者報(bào)道了很多有關(guān)橄欖苦苷提取分離富集和加工成產(chǎn)品等方面內(nèi)容[12-13]，而這些往往疏忽了加工過(guò)程中橄欖苦苷變化的研究。并且筆者通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，大量文獻(xiàn)主要集中在橄欖苦苷的提取分離及一些生物活性方面的研究，僅Malik等[14]報(bào)道了將新鮮采摘后的油橄欖葉立即放置于-80℃貯存，然后對(duì)其進(jìn)行解凍實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在室溫條件下解凍30min后，因β-葡萄糖苷酶作用使其降解了95%；而其他因素如光、pH等對(duì)橄欖苦苷作用并未詳細(xì)闡述，并且關(guān)于油橄欖葉加工過(guò)程中橄欖苦苷可能發(fā)生的變化也未見(jiàn)其他報(bào)道?；诖?，本文首次通過(guò)控制不同光源、pH、溫度和時(shí)間，研究了不同因素對(duì)油橄欖葉提取物中橄欖苦苷的變化情況。由于Fe2+是許多氧化反應(yīng)催化劑的活性中心，抑制Fe2+與催化劑的基體結(jié)合也就意味著起到了一定的抗氧化作用，因此同時(shí)也考察了油橄欖葉提取物對(duì)Fe2+的螯合作用，為油橄欖葉的有效利用提供數(shù)據(jù)及理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與儀器

油橄欖葉 佛奧品種；橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)品 天津一方科技有限公司（批號(hào)：10082613）；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT，分析純），抗壞血酸（VC，分析純）西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；菲洛嗪 分析純；乙二胺四乙酸（EDTA）分析純；甲醇 色譜純；乙醇 分析純；正己烷 分析純；異丙醇 色譜純；去離子水 自制。

AR2140電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司；WK-400A高速藥物粉碎機(jī) 青州市精誠(chéng)機(jī)械有限公司；HH-4數(shù)顯水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司；超聲波清洗器 南京壘君達(dá)超聲電子設(shè)備有限公司；LC-20A高效液相色譜（包括LC-20ATvp，SPD-20A紫外檢測(cè)器，色譜工作站LC-Solution）日本島津株式會(huì)社；HT-130色譜柱恒溫箱 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；Hypersil ODS2色譜柱 大連依利特分析儀器有限公司（批號(hào)：11164）；TG-DSC 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油橄欖葉提取物的制備 采用自然陰干的油橄欖葉（佛奧品種），粉碎至40～60目，存儲(chǔ)于陰暗干燥處備用。精確稱取50g上述備用的油橄欖葉粉于提取容器中，75%乙醇-水溶液作為提取溶劑，進(jìn)行超聲輔助提取[12]。得到的收集液再過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂進(jìn)行純化[15]，經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇并最后通過(guò)真空冷凍干燥制得的油橄欖葉提取物，所獲得的提取物再經(jīng)HPLC分析測(cè)定其中橄欖苦苷的含量（Oleuropein，27.3%）。

1.2.2 橄欖苦苷溶液的制備 精確稱取1g油橄欖葉提取物于500mL的容量瓶中，用30%乙醇溶解并得到濃度為2mg/mL溶液，作為本實(shí)驗(yàn)中的母液。

1.2.3 光對(duì)橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響 從母液中移取50mL至具塞透明玻璃瓶中，分別使用不同光源：日光燈（2000Lux）、254nm的紫外燈等對(duì)其進(jìn)行照射，并與在黑暗環(huán)境中做對(duì)比，照射時(shí)間為1h，每隔10min檢測(cè)其中的橄欖苦苷含量。

1.2.4 溫度對(duì)橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響 從母液中移取50mL至具塞透明玻璃瓶中，在不同水浴溫度50～100℃靜置3h，檢測(cè)其中橄欖苦苷含量的變化。

為了繼續(xù)研究溫度對(duì)橄欖苦苷的影響，使用橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)品，并對(duì)其做TG-DSC分析，考察高溫條件下，是否對(duì)橄欖苦苷造成分解。

1.2.5 時(shí)間對(duì)橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響 從母液中吸取50mL溶液至具塞玻璃瓶中，分別在4、25℃的黑暗條件下放置27d，定期對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)以觀察橄欖苦苷含量的變化。

1.2.6 不同pH對(duì)橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響 首先用0.1mol/L的HCl和0.1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH，配制成不同pH1～14，分別取1mL不同pH的水溶液與4mL的母液混合均勻，常溫下靜置5min，檢測(cè)其中橄欖苦苷含量的變化。

1.2.7 對(duì)金屬離子的螯合作用[16]將油橄欖葉提取物的母液稀釋成不同濃度的溶液：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/mL。分別取1.0mL不同提取物溶液與FeCl2（0.5mL，1.0mmol/L）混合均勻，再加入的菲洛嗪（1mL，5.0mmol/L），最后加入5mL水稀釋靜置10min，在562nm下檢測(cè)混合液的吸光度。本實(shí)驗(yàn)以EDTA作為參考物進(jìn)行對(duì)照。

1.2.8 油橄欖葉中橄欖苦苷含量的計(jì)算公式[17]：

2 結(jié)果與討論

2.1 光對(duì)橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響

光對(duì)橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖1，橄欖苦苷含量幾乎沒(méi)有變化。此結(jié)果說(shuō)明橄欖苦苷對(duì)實(shí)驗(yàn)條件下的常用光比較穩(wěn)定?？赡苁情蠙炜嘬瘴展獾哪芰亢?，不至于使其發(fā)生分解。但如果光的強(qiáng)度一直增大，橄欖苦苷含有的易斷裂的酯鍵和醚鍵吸收特定波長(zhǎng)的光且在強(qiáng)度夠的前提下，可能斷裂。但因?qū)嶒?yàn)條件有限，沒(méi)有繼續(xù)深入研究。

圖1 光對(duì)橄欖苦苷的影響Fig.1 Effect of light on oleuropein

2.2 溫度對(duì)橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響

溫度是所有加工過(guò)程需要考察的一個(gè)重要因素，因此溫度對(duì)橄欖苦苷的影響的考察十分有必要。在50～100℃條件下，靜置3h，橄欖苦苷并沒(méi)有發(fā)生明顯變化，如圖2所示。也即在常用加工的溫度條件下不會(huì)發(fā)生降解作用。為了繼續(xù)深入研究溫度對(duì)橄欖苦苷的穩(wěn)定性的影響，使用橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行TG-DSC分析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，從TG的結(jié)果分析，橄欖苦苷在小于232.3℃沒(méi)有發(fā)生變化，而在約232.3℃開(kāi)始發(fā)生分解，在232.3～550℃，橄欖苦苷降解作用基本完成。在550～1000℃，橄欖苦苷分解后的質(zhì)量保持恒定。另一方面，從DSC曲線分析可知，橄欖苦苷的分解是一個(gè)放熱過(guò)程。因此，要保持橄欖苦苷不降解，加工油橄欖葉的溫度不應(yīng)該超過(guò)232.3℃。

圖2 溫度對(duì)橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on oleuropein

圖3 橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)品的TG-DSCFig.3 TG-DSC of Oleuropein standard

2.3 時(shí)間對(duì)橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響

加工過(guò)程的另一個(gè)重要因素是時(shí)間。當(dāng)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，油橄欖葉中的橄欖苦苷可能會(huì)發(fā)生降解或聚合。因此，對(duì)時(shí)間的因素考察也是研究橄欖苦苷穩(wěn)定性很重要的一個(gè)方面。

如圖4所示，橄欖苦苷在第2d開(kāi)始發(fā)生降解，且隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，降解率逐漸增大，在第27d，在溫度為4℃下，橄欖苦苷降解率為38.1%，而常溫25℃下，橄欖苦苷幾乎全部降解，降解率達(dá)95.24%。之所以會(huì)發(fā)生降解，是因?yàn)橛烷蠙烊~中含有β-葡萄糖苷酶，會(huì)促進(jìn)橄欖苦苷分解[14]，25℃為該酶的最適溫度。

圖4 時(shí)間對(duì)橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of time on oleuropein stability

為提高油橄欖葉中橄欖苦苷穩(wěn)定性，筆者對(duì)油橄欖葉提取物的溶液做100℃高溫5min進(jìn)行滅酶處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在30d之內(nèi)，其中的橄欖苦苷含量幾乎沒(méi)有變化。此結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明了橄欖苦苷隨時(shí)間逐步降解的原因是由β-葡萄糖苷酶所導(dǎo)致的。

2.4 不同pH對(duì)橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，與酸性條件下相比，橄欖苦苷在堿性條件下更容易水解，在酸性條件下，橄欖苦苷幾乎沒(méi)有影響，而在堿性條件下，在pH大于10時(shí)，橄欖苦苷發(fā)生降解，而在pH為14時(shí)，橄欖苦苷已經(jīng)全部降解，因此，橄欖苦苷耐酸不耐堿，其結(jié)果與王成章等[18]的研究結(jié)果一致，作用過(guò)程如圖6（b）所示，橄欖苦苷在酸或堿作用下生成羥基酪醇和欖香酸。

圖5 pH對(duì)橄欖苦苷穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of pH on oleuropein

圖6 橄欖苦苷在酸堿及酶的條件下分解作用Fig.6 Oleuropein decomposition process on acid，alkali and enzyme conditions stability

2.5 對(duì)金屬離子的螯合作用

圖7 螯合亞鐵離子的作用Fig.7 Chelation action of ferrous ions

由圖7可知，在螯合亞鐵實(shí)驗(yàn)中，EDTA螯合作用最強(qiáng)且效果較明顯，在其濃度為0.8mg/mL時(shí)，螯合率為96.7%；而油橄欖葉提取物螯合作用較低，油橄欖葉提取物（OLE）隨著濃度的升高，OLE的螯合作用增強(qiáng)。在其濃度為1.2mg/mL時(shí)，螯合率能達(dá)約20%。因此，提取物在一定條件下，可以充當(dāng)螯合劑，作為輔助抗氧化作用，因?yàn)樯矬w內(nèi)很多氧化反應(yīng)的酶中需要亞鐵離子的催化作用，OLE螯合亞鐵離子也就抑制了相關(guān)氧化反應(yīng)的過(guò)程，也就防止了氧化損傷，起到了抗氧化作用。

3 結(jié)論

3.1 橄欖苦苷對(duì)常用光比較穩(wěn)定；在3h、100℃的條件下，橄欖苦苷含量沒(méi)有發(fā)生降解；橄欖苦苷的降解溫度為232.3℃，并且該過(guò)程是一個(gè)放熱過(guò)程。

3.2 橄欖苦苷較酸性環(huán)境中在堿性條件下容易分解，在pH為14時(shí)，橄欖苦苷將全部降解。

3.3 當(dāng)提取物濃度為1.2mg/mL時(shí)，對(duì)亞鐵離子的螯合率約為20%，明顯低于EDTA（0.8mg/mL時(shí)，螯合率為96.7%）。

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