柚皮膳食纖維對(duì)去勢(shì)雌性大鼠腸道發(fā)酵的影響

彭 林，桂 余，任文瑾，唐 艷，劉 雄

(重慶西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶北碚400715)

柚(Citrus maxima)是蕓香科植物柚的成熟果實(shí)，產(chǎn)于我國(guó)福建、江西、廣東、廣西等南方地區(qū)。柚子清香、涼潤(rùn)，營(yíng)養(yǎng)豐富，藥用價(jià)值很高，是醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的最具食療效益的水果。柚皮是柚子加工的副產(chǎn)品，不僅具有化痰，消食，下氣等藥用價(jià)值，還含有豐富的膳食纖維、微量元素以及多種生理活性成分，是一種潛在的、優(yōu)良的膳食纖維資源［1］。對(duì)其進(jìn)行研究應(yīng)用，既可大量獲得高純度膳食纖維，又可解決柚皮堆砌腐敗造成的環(huán)境污染問(wèn)題。

膳食纖維(dietary fiber，DF)是指能抗人體小腸消化吸收而能在大腸部分或全部發(fā)酵的可食用的植物性成分、碳水化合物及其相類似物質(zhì)的總稱。按其溶解性特性，可分為可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber，SDF)和不可溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber，IDF)兩大類。大量研究表明，DF具有防治便秘［2］，降低血壓［3］，預(yù)防冠心?。?－5］，改善糖尿病癥狀［6］等多種生理功能。此外，DF在預(yù)防人體胃腸道疾病和維護(hù)胃腸道健康方面具有突出的功能作用。DF在腸道內(nèi)易被腸道細(xì)菌酵解，產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸(SCFA)，不僅影響肝臟中糖、脂代謝，還能夠降低腸道內(nèi)環(huán)境的 pH［7－9］。通常，腸道健康的改善與降低腸道pH、增加SCFAs產(chǎn)量、降低腸道中氨濃度、減少腸道中次級(jí)膽汁酸的分泌和改善細(xì)菌活性等方面相關(guān)［10］。柚皮中含有豐富的膳食纖維，而從柚皮中提取的可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維能否改善腸道健康還有待研究。本文主要通過(guò)對(duì)雌性大鼠進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)，模擬建立更年期模型實(shí)驗(yàn)，研究探討了飼料中添加柚皮原料以及柚皮中提取的可溶性膳食纖維、不溶性膳食纖維對(duì)去勢(shì)雌性大鼠體重、盲腸及其內(nèi)容物pH、SCFAs、游離氨的影響。

表1 大鼠實(shí)驗(yàn)分組Table 1 Experimental group of rats

表2 實(shí)驗(yàn)飼料組成(g/kg)Table 2 Composition of experimental diets(g/kg)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雌性SD大鼠 購(gòu)自重慶滕鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司;柚皮(梁平柚柚皮) 本地市場(chǎng)收集;柚皮可溶性膳食纖維和柚皮不溶性膳食纖維 實(shí)驗(yàn)室自提(基本成分見表3);L－胱氨酸(生化試劑)、氯化膽堿、氯化鈉、苯酚、氯化銨、氫氧化鈉(以上均為分析純) 購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠;酪蛋白(食品級(jí))購(gòu)自華羚集團(tuán)公司;玉米淀粉(食品級(jí))購(gòu)自西安國(guó)維淀粉有限責(zé)任公司;鹽酸、硫酸(優(yōu)級(jí)純)購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠;巴豆酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸(以上均為色譜純)購(gòu)自梯希愛(ài)上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司。

GC－2010高效氣相色譜儀 日本島津公司;WH－1微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠;PHS－3C型精密酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司;Spectrumlab 22可見光分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司;JA2003A型電子天平 上海精天電子儀器有限公司;DHG－9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;5810型臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;SIGMA低溫離心機(jī) 德國(guó)SIGMA公司;HH－B11電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;ES－315高壓蒸汽滅菌鍋 KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 更年期綜合癥大鼠模型的建立 將體重為120～150g的4周齡SD雌性大鼠40只，每只單籠飼養(yǎng)在不銹鋼大鼠籠中，室溫(25±1)℃，12h明暗輪換(9:00～21:00)。以基礎(chǔ)飼料喂食1周，適應(yīng)喂養(yǎng)環(huán)境后，按大鼠體重隨機(jī)分為5組(分組情況見表1)，腹部注射戊巴比妥鈉(無(wú)菌生理鹽水配制0.3%溶液，注射量1mL/100g大鼠體重)使其麻醉，任選一組進(jìn)行偽切除手術(shù)(Sham)，其余4組進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)(OVX)。手術(shù)后基礎(chǔ)飼料進(jìn)行1周的恢復(fù)。

1.2.2 大鼠飼養(yǎng)與樣品采集 恢復(fù)一周后，將OVX大鼠按體重隨機(jī)分為4組，分別為空白組(OVXCN)、柚皮可溶性膳食纖維組(PPSDF)、柚皮不溶性膳食纖維組(PPIDF)、柚皮原料組(PP)(飼料配方見表2)。偽切除手術(shù)大鼠采食基礎(chǔ)飼料(Sham－CN)，所有大鼠自由采食和飲水，每天記錄大鼠采食量，實(shí)驗(yàn)周期為4周。實(shí)驗(yàn)期最后4天收集大鼠糞便，真空冷凍干燥后稱重，貯存在干燥器中。實(shí)驗(yàn)期最后一天斷糧12h，19:00～21:00乙醚麻醉后斷頭處死大鼠，剖腹取出小腸，用冰凍生理鹽水沖洗出小腸內(nèi)容物，收集在試管中，真空冷凍干燥后稱重。取出大鼠盲腸連同內(nèi)容物一起稱重，將盲腸組織縱向剪開，收集盲腸內(nèi)容物，－80℃冷凍備用;將刮出內(nèi)容物后的盲腸壁用生理鹽水洗凈，用吸水紙吸干水分后稱重，用鋁箔紙包好4℃冷藏備用。

1.2.3 盲腸內(nèi)容物含水率測(cè)定 稱取一定質(zhì)量的盲腸內(nèi)容物，放入已恒重的鋁盒中，烘箱105℃恒重，測(cè)定其含水率。

表3 基本化學(xué)成分(%)Table 3 Basic chemical component(%)

式中:m1:盲腸內(nèi)容物濕重，g;m:盲腸內(nèi)容物干重，g

1.2.4 盲腸壁表面積測(cè)定［11］用生理鹽水洗凈盲腸壁，用吸水紙吸干水分，充分展開后固定在劃有標(biāo)準(zhǔn)刻度線(cm)的白色塑料板上，用數(shù)碼相機(jī)拍攝展開的盲腸，將盲腸照片用打印紙打印，然后將紙上的盲腸輪廓圖剪下，測(cè)出照片上的1厘米刻度線的長(zhǎng)度(L，cm)，用精度為0.0001g的電子稱精確稱量輪廓圖紙重量(W1，g)和平方厘米的紙重量(W2，g)，然后按以下公式計(jì)算出盲腸表面積:

1.2.5 盲腸內(nèi)容物pH測(cè)定 稱取0.2g左右的盲腸內(nèi)容物置于去離子水預(yù)處理過(guò)的10mL離心管中，加入10倍重量的去離子水，旋渦混合儀上混勻后，離心機(jī)4000r/min離心10min，靜置，測(cè)上清液pH。

1.2.6 盲腸內(nèi)容物游離氨測(cè)定［12］稱取0.2g左右盲腸內(nèi)容物于10mL離心管中，加入10倍重量的無(wú)氨水，充分混勻后在4000r/min下離心5min，吸取上清液1mL，依次加入1mL含有0.001mol/L亞硝基鐵氰化鈉的0.5mol/L苯酚溶液和1mL含有0.03mol/L次氯酸鈉的0.625mol/L氫氧化鈉溶液，60℃保溫5min，625nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。

1.2.7 盲腸內(nèi)容物SCFA測(cè)定［12］稱取約0.2g盲腸內(nèi)容物放入超純水處理過(guò)的10mL離心管中，立即加入2mL含有5mmol/L巴豆酸的10mmol/L NaOH溶液，旋渦混合儀上充分混勻后，靜置1h，在4000r/min下離心15min;吸取上清液，繼續(xù)在10000r/min下離心15min;吸取上清液 0.6mL，加入 0.6mL氯仿，4000r/min下離心15min;用1mL注射器吸取上清液，0.22μm濾膜過(guò)濾至2mL進(jìn)樣瓶待測(cè)。

色譜條件:進(jìn)樣量:1μL;進(jìn)樣口溫度:220℃;柱流量:0.95mL/min，柱箱溫度90℃、平衡時(shí)間0.5min，5℃/min升溫至150℃，保留時(shí)間7min;檢測(cè)器溫度230℃;氫氣流量40mL/min，空氣流量400mL/min，尾吹流量40mL/min。

1.2.8 盲腸內(nèi)容物中微生物的測(cè)定 取一定質(zhì)量m1(0.150～0.350)的凍結(jié)盲腸內(nèi)容物，加入9倍重量/體積的無(wú)菌生理鹽水，渦旋混勻，得到10－1稀釋度，依次稀釋至10－7，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，每種菌選擇合適的三個(gè)稀釋度進(jìn)行接種，接種量為200μL，用于大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的培養(yǎng)計(jì)數(shù)。大腸桿菌培養(yǎng)選用EMB培養(yǎng)基，腸球菌選用腸球菌瓊脂(膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂)培養(yǎng)基，37℃下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h計(jì)數(shù)。雙歧桿菌和乳酸桿菌分別選用TPY瓊脂培養(yǎng)基和乳酸桿菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基，37℃下二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)72h計(jì)數(shù)。結(jié)果以lg cfu/g表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以mean±SD表示，各組間顯著性差異采用SPSS分析，p＜0.05被認(rèn)為有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本化學(xué)組成分析

柚皮原料、柚皮可溶性膳食纖維和柚皮不溶性膳食纖維基本化學(xué)組成分析見表3。

由表3可知，柚皮原料主要由不可溶性膳食纖維素、果膠、淀粉、蛋白質(zhì)、灰分和少量脂肪等組成。而所提取的柚皮可溶性膳食纖維中果膠純度達(dá)到84.3%，此外，所提取的柚皮不溶性膳食纖維純度達(dá)到87.7%，僅殘留了少量的蛋白質(zhì)、脂肪和灰分。

2.2 柚皮膳食纖維對(duì)OVX大鼠體重、采食量、飼料效率的影響

從表4可以看出，偽切除組與空白組相比較，空白組的體重增加量、采食量和飼料效率均有升高的趨勢(shì)，其中體重增加量達(dá)到極顯著(p＜0.01)水平，飼料效率達(dá)到顯著(p＜0.05)水平;與空白組相比，柚皮可溶性膳食纖維組、柚皮不溶性膳食纖維組和柚皮原料組OVX大鼠的體重增加量和飼料效率均有下降的趨勢(shì)，其中可溶性膳食纖維組達(dá)到顯著(p＜0.05)水平;各組采食量沒(méi)有明顯的變化。

柚皮可溶性膳食纖維和柚皮不溶性膳食纖維能夠降低OVX大鼠體重和飼料效率，且柚皮可溶性膳食纖維下降達(dá)到顯著(p＜0.05)水平?？梢姡制ど攀忱w維，特別是柚皮可溶性膳食纖維能夠抑制OVX大鼠的體重增長(zhǎng)，達(dá)到防止肥胖的目的。

2.3 柚皮膳食纖維對(duì)OVX大鼠小腸內(nèi)容物、糞便重量以及盲腸表面積、重量的影響

從表5可以看出，與空白組相比，偽切除組大鼠小腸內(nèi)容物、糞便重量以及盲腸表面積、重量均沒(méi)有明顯變化;柚皮可溶性膳食纖維組、柚皮不溶性膳食纖維組和柚皮原料組的小腸內(nèi)容物重均有升高的趨勢(shì)，但沒(méi)有達(dá)到顯著水平。此外，相較于空白組，柚皮可溶性膳食纖維組、柚皮不溶性膳食纖維組和柚皮原料組的糞便干重、盲腸壁濕重以及盲腸表面積均有顯著(p＜0.05)升高的趨勢(shì)。

在飼料中添加柚皮可溶性膳食纖維、柚皮不溶性膳食纖維和柚皮原料均能增加OVX大鼠的糞便干重、盲腸壁濕重以及盲腸表面積。可見，柚皮膳食纖維不僅能夠增加糞便體積，促進(jìn)排便，還能幫助盲腸組織的代謝和更新、保護(hù)其形態(tài)和功能，起到調(diào)節(jié)腸道功能的作用。

表4 柚皮膳食纖維對(duì)OVX大鼠體重、采食量、飼料效率的影響Table 4 Effect of dietary fibre from pomelo peel on body weight gain，feed intake and feed conversion efficiency in ovariectomized rats

表5 柚皮膳食纖維對(duì)OVX大鼠小腸內(nèi)容物、糞便重量及盲腸表面積、重量的影響Table 5 Effect of dietary fibre from pomelo peel on the weight of small intestine contents and feces，the weight and area of cecal tissue in ovariectomized rats

表6 柚皮膳食纖維對(duì)OVX大鼠盲腸內(nèi)容物的影響Table 6 Effect of dietary fibre from pomelo peel on cecal contents in ovariectomized rats

表7 柚皮膳食纖維對(duì)OVX大鼠盲腸內(nèi)容物中游離氨的影響Table 7 Effect of dietary fibre from pomelo peel on cecal contents FA in ovariectomized rats

2.4 柚皮膳食纖維對(duì)OVX大鼠盲腸內(nèi)容物的影響

從表6可以看出，偽切除組與空白組相比較，空白組的盲腸內(nèi)容物pH有顯著(p＜0.05)升高的趨勢(shì)，而含水率有下降的趨勢(shì);可見，雌性大鼠切除卵巢后會(huì)引起大鼠腸道環(huán)境發(fā)生改變，影響腸道健康。相較于空白組，柚皮可溶性膳食纖維組、柚皮不溶性膳食纖維組和柚皮原料組OVX大鼠的盲腸內(nèi)容物重量均有顯著(p＜0.05)升高的趨勢(shì)。此外，與空白組相比，柚皮可溶性膳食纖維組、柚皮不溶性膳食纖維組和柚皮原料組OVX大鼠盲腸內(nèi)容物的含水率均有上升的趨勢(shì)，而pH均有下降的趨勢(shì)，其中柚皮可溶性膳食纖維組和柚皮不溶性膳食纖維組pH下降達(dá)到顯著(p＜0.05)水平?？梢?，柚皮膳食纖維具有較強(qiáng)的吸水力和溶脹性，不僅能夠增加盲腸內(nèi)容物的重量和含水率，防治便秘;還能降低盲腸內(nèi)容物pH，從而改善腸道環(huán)境。

2.5 柚皮膳食纖維對(duì)OVX大鼠盲腸內(nèi)容物中游離氨的影響

從表7可以看出，與OVX空白組相比，偽切除組大鼠盲腸內(nèi)容物游離氨濃度有下降的趨勢(shì);柚皮可溶性膳食纖維組、柚皮不溶性膳食纖維組和柚皮原料組OVX大鼠盲腸內(nèi)容物中游離氨的濃度相較于空白組均有下降的趨勢(shì)，其中柚皮可溶性膳食纖維組和柚皮不溶性膳食纖維組達(dá)到顯著(p＜0.05)水平。由此可見，在飼料中添加柚皮可溶性膳食纖維、柚皮不溶性膳食纖維和柚皮原料均能降低OVX大鼠盲腸內(nèi)容物中游離氨濃度，從而改善腸道發(fā)酵環(huán)境。

2.6 柚皮膳食纖維對(duì)OVX大鼠盲腸內(nèi)容物SCFA的影響

從表8可以看出，與OVX空白組相比，偽切除組大鼠盲腸內(nèi)容物SCFA濃度沒(méi)有明顯變化，此外，相較于OVX空白組，柚皮可溶性膳食纖維組、柚皮不溶性膳食纖維組和柚皮原料組OVX大鼠盲腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸濃度和總SCFAs濃度均具有顯著(p＜0.05)升高的趨勢(shì)，柚皮不溶性膳食纖維組的增加趨勢(shì)最為明顯，異丁酸濃度沒(méi)有明顯變化。

表8 柚皮膳食纖維對(duì)OVX大鼠盲腸內(nèi)容物SCFA的影響Table 8 Effect of dietary fibre from pomelo peel on cecal contents SCFAs in ovariectomized rats

表9 柚皮膳食纖維對(duì)OVX大鼠盲腸內(nèi)容物微生物的影響Table 9 Effect of dietary fibre from pomelo peel on cecal contents microbe in ovariectomized rats

短鏈脂肪酸能夠維持結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞的代謝和更新、保護(hù)結(jié)腸上皮的形態(tài)和功能、改善腸道健康?？梢?，飼料中添加柚皮可溶性膳食纖維、柚皮不溶性膳食纖維和柚皮原料均能顯著(p＜0.05)增加OVX大鼠盲腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸以及總短鏈脂肪酸濃度，從而改善腸道健康。

2.7 柚皮膳食纖維對(duì)OVX大鼠盲腸內(nèi)容物中微生物的影響

從表9可以看出，與OVX空白組相比，偽切除組大鼠盲腸內(nèi)容物中雙歧桿菌、大腸桿菌和腸球菌的數(shù)量均有顯著增加的趨勢(shì);柚皮可溶性膳食纖維組、柚皮不溶性膳食纖維組和柚皮原料組OVX大鼠盲腸內(nèi)容物中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量均有顯著(p＜0.05)增加的趨勢(shì);而大腸桿菌和腸球菌的數(shù)量均有顯著(p＜0.05)下降的趨勢(shì)。

結(jié)果表明，在飼料中添加柚皮可溶性膳食纖維和柚皮不溶性膳食纖維會(huì)使OVX大鼠盲腸內(nèi)容物中的有益微生物雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量增加，而使有害微生物大腸桿菌和腸球菌的數(shù)量減少?？梢姡制た扇苄陨攀忱w維和柚皮不溶性膳食纖維能夠影響OVX大鼠腸道內(nèi)微生物的生長(zhǎng)，使大鼠腸道環(huán)境得到改善。

3 結(jié)論

膳食纖維在預(yù)防人體胃腸道疾病和維護(hù)胃腸道健康方面具有突出的功能作用。Takahashi H等［13］研究發(fā)現(xiàn)，水溶性膳食纖維可通過(guò)增加糞便含水率、糞便中乳桿菌含量以及增加排便頻率等多方面改善便秘癥狀。不溶性膳食纖維具有較強(qiáng)的吸水力和溶脹性，能夠增加糞便的體積和柔軟度，增大糞便對(duì)腸壁的壓力，刺激腸道收縮，加快腸道積物的排出速度，防止便秘的發(fā)生［14］。本研究結(jié)果中，飼料中添加柚皮可溶性膳食纖維、柚皮不溶性膳食纖維和柚皮原料均能夠顯著(p＜0.05)增加去勢(shì)雌性大鼠的盲腸內(nèi)容物重量和糞便干重，促進(jìn)排便。此外，有研究表明，膳食纖維可在人體結(jié)腸腸道菌群作用下發(fā)生酵解，產(chǎn)生多種終產(chǎn)物，如甲烷、氫、二氧化碳和SCFAs(乙酸、丙酸和丁酸等)［15－16］，SCFAs 是結(jié)腸粘膜上皮重要的能量物質(zhì)［17－18］，具有維持結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞的代謝和更新、保護(hù)結(jié)腸上皮的形態(tài)和功能、調(diào)節(jié)腸道的功能。本研究結(jié)果表明，飼料中添加柚皮可溶性膳食纖維、柚皮不溶性膳食纖維和柚皮原料均能明顯增加去勢(shì)雌性大鼠的盲腸壁濕重、盲腸組織面積以及短鏈脂肪酸含量。

人體腸道中存在大量菌群，既生活著有益菌群，也生活著有害菌群。膳食纖維易被腸內(nèi)有益菌完全或部分酵解，產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸。SCFAs可調(diào)節(jié)腸道pH，改善有益菌的繁殖環(huán)境，使雙歧桿菌、乳酸菌等有益菌增殖。這對(duì)抑制腐生菌生長(zhǎng)、防止腸道黏膜萎縮、維持維生素代謝、保護(hù)肝臟等都是十分重要的［19］。有益微生物大量繁殖，利用發(fā)酵底物中的氮源，從而使盲腸內(nèi)容物中游離氨濃度降低。本研究結(jié)果表明，與OVX空白組相比，柚皮可溶性膳食纖維組、柚皮不溶性膳食纖維組和柚皮原料組OVX大鼠盲腸內(nèi)容物中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量均有顯著(p＜0.05)增加的趨勢(shì);而大腸桿菌和腸球菌的數(shù)量均有顯著(p＜0.05)下降的趨勢(shì)。此外，飼料中添加柚皮可溶性膳食纖維、柚皮不溶性膳食纖維和柚皮原料還能夠顯著降低盲腸內(nèi)容物的pH和游離氨的含量。

綜上所述，飼料中添加柚皮可溶性膳食纖維、柚皮不溶性膳食纖維和柚皮原料均能明顯促進(jìn)去勢(shì)雌性大鼠腸道的發(fā)酵作用，不僅顯著(p＜0.05)增加去勢(shì)雌性大鼠的盲腸壁濕重、盲腸面積、盲腸內(nèi)容物重量以及短鏈脂肪酸含量，還能增加腸道內(nèi)有益菌的數(shù)量并抑制有害菌生長(zhǎng)，并降低盲腸內(nèi)容物pH和游離氨的含量，從而改善腸道環(huán)境。

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