楓香葉揮發(fā)油抗炎及其凝血作用以及化學(xué)成分的研究

楊朝竣，張韻慧，馮 靖，姚小青，晉興華，*

（1.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072；2.天津紅日藥業(yè)股份有限公司，天津 301700）

楓香（Liquidambarformosana）為金縷梅科（Hamamelidaceae）楓香亞科楓香屬植物，別名三角楓、黑飯木等，是我國(guó)重要的鄉(xiāng)土樹種，也是亞熱帶地區(qū)優(yōu)良速生落葉闊葉樹種[1]。楓香樹葉氣香、性涼，具有化瘀、止血、止咳、化痰、解毒等功效[2-3]。楓香葉作為一種天然藥食同源植物資源，越來越受到國(guó)內(nèi)外功能保健及醫(yī)藥等領(lǐng)域的關(guān)注，在廣西、云南等少數(shù)民族地區(qū)，楓香葉作為民間食品、清涼茶飲品的應(yīng)用歷史悠久。揮發(fā)油成分在我國(guó)民間和藥用史上應(yīng)用歷史悠久。為了廣泛開發(fā)我國(guó)天然食用、藥用資源，本文應(yīng)用BEAS-2B人肺上皮細(xì)胞炎癥模型，加入地塞米松+TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照組（Dex）、楓香葉揮發(fā)油+TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組，通過檢測(cè)IL-6蛋白的表達(dá)量，來評(píng)價(jià)揮發(fā)油的抗炎效果，采用體外血漿復(fù)鈣實(shí)驗(yàn)研究了楓香葉中經(jīng)水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油成分的抗炎及其促凝血活性，并對(duì)在實(shí)驗(yàn)條件下所提取得到的具有活性作用的揮發(fā)油物質(zhì)成分應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，共鑒定出26種化合物，其中10種化合物為首次報(bào)導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

楓香葉 產(chǎn)地：廣西省，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)黃世渠教授鑒定為楓香葉Liquidambar formosana的全葉，對(duì)照由天津大學(xué)藥學(xué)院保存；冷凍血漿 由天津血液中心提供健康人血漿，-25℃保存；云南白藥 購(gòu)于天津中舟大藥房；PBS緩沖液 pH=7.1，NaCl：0.13mmol/L，KCl：2.7mmol/L，Na2HPO4：12mmol/L，KH2PO4：1.5mmol/L，棕色瓶保存；胎牛血清FBS Biological industries公司；青霉素-鏈霉素（P/S）、DMEM高糖培養(yǎng)基 HyClone公司；地塞米松DEX Sigma公司；人源腫瘤壞死因子－α（TNF－α）Pepro Tech.Inc；人白細(xì)胞介素6 ELISA試劑盒 IL－6上海西唐生物科技有限公司。

Agilent6820氣相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；Finnigan TRACE MS 2000氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀器美國(guó)Thermo Finnigan公司；HU3120B超聲波儀 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；XS205分析天平 METTLER公司；超純水儀 Milli－QMILLIPORE，USA；單孔化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀 Promega公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備揮發(fā)油 取清潔楓香葉10g，加入料液比為（1∶10.35）的蒸餾水浸泡2.4h，攪拌機(jī)中打漿后置圓底燒瓶中，加水和少許沸石，緩慢蒸餾2.7h。收集揮發(fā)油提取器中得到的油層。加入乙醚稀釋并加入無水硫酸鈉干燥過夜。吸取過夜后的樣品溶液、用有機(jī)膜過濾，得到待測(cè)液體。該液體為淺黃色，具有明顯的楓香葉香氣。經(jīng)計(jì)算得揮發(fā)油收率為1.654%。為了便于表達(dá)，將楓香葉揮發(fā)油簡(jiǎn)寫為“FXY”。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) BEAS－2B人肺上皮細(xì)胞培養(yǎng)于5%CO2－95%O2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃。用含10%胎牛血清FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，以1×105/孔接種于96孔板。楓香葉揮發(fā)油抗炎實(shí)驗(yàn)前換用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，揮發(fā)油用無血清培養(yǎng)基溶解，地塞米松濃度為10－6mol/L，揮發(fā)油濃度分別為5、50、500μg/mL。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及IL－6的ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分組 加入與實(shí)驗(yàn)組等體積生理鹽水的無藥無TNF－α誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)基空白組（Control）、加入與實(shí)驗(yàn)組等體積生理鹽水的TNF－α（5ng/mL）誘導(dǎo)細(xì)胞無藥對(duì)照模型組（TNF－α Model）、地塞米松（10－6mol/L）+TNF－α（5ng/mL）誘導(dǎo)細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照組（Dex）、楓香葉揮發(fā)油（5、50、500μg/mL）+TNF－α（5ng/mL）誘導(dǎo)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組。

空白（Control）組加入相應(yīng)體積生理鹽水直接培養(yǎng)18h，其余4組的實(shí)驗(yàn)方法為：加入不同濃度揮發(fā)油、地塞米松預(yù)處理1h，再添加5ng/mL TNF－α的培養(yǎng)6h后再加培養(yǎng)基培養(yǎng)12h。收集細(xì)胞上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)IL－6蛋白的表達(dá)量。

1.2.4 楓香葉揮發(fā)油血漿復(fù)鈣實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[4]方法，取內(nèi)徑為10mm試管，分別依次加入0.1mL血漿、0.1mL不同濃度的揮發(fā)油、0.1mL氯化鈣溶液，混勻，立即計(jì)時(shí)。37℃保溫40s后，取出試管緩慢傾斜，觀察溶液流動(dòng)情況，如停止流動(dòng)立即記時(shí)?？瞻讓?duì)照組為PBS緩沖液（0.1mol/L）；陽(yáng)性對(duì)照組為云南白藥（50mg/L）。平行實(shí)驗(yàn)6次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示。建立藥物濃度與血漿復(fù)鈣時(shí)間的藥效關(guān)系，以凝血時(shí)間縮短率作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)：

凝血時(shí)間縮短率（%）=（空白組血凝時(shí)間－給藥組血凝時(shí)間）/空白組血凝時(shí)間×100。

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。組間比較采用單因素方差分析（One－wayANOVA）。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.5 氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定揮發(fā)油物質(zhì)結(jié)構(gòu)

1.2.5.1 氣相色譜條件 儀器：Agilent GC 6820；色譜柱：Agilent HP－5彈性石英毛細(xì)管柱：（5%）－二苯基硅氧烷共聚物色譜柱（30m×0.32mm i.d.，0.25μm）；載氣：氮?dú)?；進(jìn)樣量：0.2μL；進(jìn)樣口溫度：300℃；檢測(cè)器（FID）溫度：300℃；程序升溫：起始溫度40℃，保持3min，以20℃/min升至90℃，保持1min，繼續(xù)以4℃/min升至280℃，保持2min。記錄色譜圖。

1.2.5.2 氣相－質(zhì)譜條件 儀器：Finnigan TRACE MS2000氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀；色譜柱：DB－5MS型彈性毛細(xì)管柱，（5%苯基）—甲基聚硅氧烷色譜柱（30m×0.25mm i.d，0.25μm）；載氣：氦氣；流速：1mL/min；升溫程序：起始溫度40℃保持3min，20℃/min程序升溫升至90℃保持1min，以4℃/min升至280℃保持2min；進(jìn)樣口溫度：280℃；檢測(cè)器溫度：280℃；進(jìn)樣量：0.2μL；分流比：1∶40。質(zhì)譜條件：EI電離，離子源溫度：280℃；電子能量：70eV；掃描范圍：m/z35～450；掃描速度：2000amu/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 楓香葉揮發(fā)油抗炎作用實(shí)驗(yàn)

圖1所示與空白對(duì)照組（Control）相比，TNF－α模型組TNF－α刺激后BEAS－2B細(xì)胞IL－6表達(dá)顯著升高。圖1可見，與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)性藥組和揮發(fā)油高劑量組（50、500μg/mL）顯示了顯著的抑制效果。

圖1 楓香葉揮發(fā)油對(duì)BEAS－2B細(xì)胞IL－6表達(dá)的影響Fig.1 Effect of the FXY oil to the expression of IL－6 on BEAS－2B cells

2.2 楓香葉揮發(fā)油的血漿復(fù)鈣實(shí)驗(yàn)

楓香葉揮發(fā)油FXY，有效濃度在5～100mg/L范圍對(duì)血漿的凝集作用數(shù)據(jù)見表1。當(dāng)楓香葉揮發(fā)油濃度為100mg/L時(shí)，促凝作用最強(qiáng)，其凝血時(shí)間縮短率與陽(yáng)性對(duì)照的縮短率相近。

表1 楓香葉揮發(fā)油FXY對(duì)凝血時(shí)間的影響（n=6）Table 1 The influence on plasma recalcification time of FXY oils（n=6）

2.3 鑒定結(jié)果

圖2 楓香葉揮發(fā)油氣相色譜圖Fig.2 The gas chromatograph of volatile oil from maple leaves

楓香葉揮發(fā)油的氣相色譜圖見圖2。楓香葉揮發(fā)油經(jīng)GC-MS分離鑒定得到的氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖見圖3。

將各色譜峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖經(jīng)質(zhì)譜庫(kù)（NIST05）自動(dòng)檢索、人工檢索和解析，共鑒定出相似度（SI）達(dá)85%以上的化合物26個(gè)，占揮發(fā)油總含量的93.22%，結(jié)果見表2。其中包含19種萜烯類物質(zhì)，占揮發(fā)油總含量的91.33%；5種脂肪族物質(zhì)，占揮發(fā)油總含量的0.93%；2種芳香族物質(zhì)，占揮發(fā)油總含量的0.96%。其中揮發(fā)油成分中的β-月桂烯、α-水芹烯、鄰甲基異丙烯苯、1，5，5，6-四甲基-1，3-環(huán)己二烯、α-石竹烯、（+）-表雙環(huán)倍半水芹烯、（+）-喇叭烯、γ-欖香烯、藍(lán)桉醇、角鯊烯10種成分為首次報(bào)道。

圖3 楓香葉揮發(fā)油氣相質(zhì)譜總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of components of volatile oil from maple leaves

3 結(jié)論

3.1 TNF-α是一種由內(nèi)毒素激活的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等分泌的一種多活性的細(xì)胞因子，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的具有促進(jìn)炎癥作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子，能刺激細(xì)胞因子IL-6的釋放，介導(dǎo)創(chuàng)傷后細(xì)胞炎性反應(yīng)。而IL-6是一種活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，能使B細(xì)胞前體成為產(chǎn)生抗體的細(xì)胞；和集落刺激因子協(xié)同，能促進(jìn)原始骨髓源細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，它與多種疾病如腫瘤、感染、發(fā)熱和內(nèi)毒素性休克等反應(yīng)發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，且創(chuàng)傷越嚴(yán)重，IL-6值越高。IL-6監(jiān)測(cè)對(duì)炎癥的輔助診斷、分期及預(yù)后判斷具有重要意義[5]。細(xì)胞炎癥實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，楓香葉中的揮發(fā)油具有很好的抗炎作用。

表2 楓香葉揮發(fā)油化學(xué)成分分析結(jié)果Table 2 Analysis results of the volatile oil from leaves of L.formosana

3.2 止血包括血液凝固、血小板聚集和血管收縮3個(gè)重要因素。當(dāng)外傷或疾病出血時(shí)可見受損局部血管收縮，血小板在血管破損處凝集，啟動(dòng)內(nèi)源性及外源性凝血途徑完成凝血過程，形成血塊而止血[6]。血漿復(fù)鈣實(shí)驗(yàn)表明，楓香葉揮發(fā)油很可能對(duì)凝血酶具有活化作用，通過增加凝血酶的活性，激活血小板，促進(jìn)血栓形成，實(shí)現(xiàn)止血作用。

3.3 通過氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)楓香葉中揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，鑒定出26種化合物，其中10種化合物：β-月桂烯、α-水芹烯、鄰甲基異丙烯苯、1，5，5，6-四甲基-1，3-環(huán)己二烯、α-石竹烯、（+）-表雙環(huán)倍半水芹烯、（+）-喇叭烯、γ-欖香烯、藍(lán)桉醇、角鯊烯為首次報(bào)道。有文獻(xiàn)曾報(bào)導(dǎo)其中成分α-蒎烯（34.48%）、β-蒎烯（19.25%）和檸檬烯（26.97%）的作用主要為抑制白色念珠菌的生物合成以及抗炎促凝血作用[7]。而以上本文首次報(bào)道的γ-欖香烯、藍(lán)桉醇、角鯊烯成分都具有抗氧化、抗腫瘤效果[8-10]。揮發(fā)油成分的結(jié)構(gòu)鑒定進(jìn)一步佐證了上文抗炎以及促凝血實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)研究所進(jìn)行的楓香葉揮發(fā)油抗炎及促凝血作用和其中物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定具有一定的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值，擴(kuò)大了其在藥品和食品等方面的應(yīng)用。本研究為楓香葉藥材的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供了研究應(yīng)用的理論基礎(chǔ)。

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