871家蠶膽固醇含量分析

谷留杰，高貴田，* ，段愛莉，孫翔宇，趙金梅，張義方

(1.陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710062;2.安康學院陜西省蠶桑重點實驗室，陜西安康725000;3.安康市蠶桑研究所，陜西安康725019)

膽固醇廣泛存在于動物體中，是動物細胞膜的重要成分，也是動物合成固醇類激素、維生素D的原料及膽汁酸的前體，是細胞多種生理活動所必需的。對于人體正常代謝，膽固醇也具有重要作用。但是，膽固醇攝入過量易導(dǎo)致血液膽固醇含量升高，進而誘發(fā)高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病等眾多心腦血管疾?。?－2］?，F(xiàn)代醫(yī)學和營養(yǎng)學研究發(fā)現(xiàn)，食物中膽固醇的攝入量應(yīng)不超過250～300mg/d人。目前膽固醇的測定方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、鄰苯二甲醛分光光度計比色法、薄層層析法及酶法等。與其它方法相比，高效液相色譜方法準確而快速。李黎等采用高效液相色譜法測定了食品中的膽固醇［3］，李杰等［4］采用高效液相色譜法快速測定了黑甜玉米油中的膽固醇。但目前為止家蠶中膽固醇含量的測定尚未見報道。家蠶(Bombyx mori)是公認的保健和滋補食療珍品，在漢代就有用家蠶控制糖尿病的記載?！洱R民要術(shù)》、《本草綱目》也記載了家蠶食用和藥用功能［5］。不同蟲態(tài)的家蠶(卵、幼蟲、蛹、成蟲)均含有豐富的蛋白質(zhì)、油脂、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)。干蠶粉蛋白質(zhì)含量為50%～55%，其中必需氨基酸占氨基酸總量的40%以上，且18種氨基酸的配比和必需氨基酸的含量均符合聯(lián)合國糧農(nóng)/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)所規(guī)定的理想蛋白質(zhì)模式［6］;干蠶蛹中油脂含量30%以上，其中不飽和脂肪酸含量占油脂總量的70%以上［7－8］。在中國、日本、泰國和其它亞太國家，蠶蛹作為常見膳食組分被廣泛食用［9－11］。目前，蠶蛹深加工發(fā)展迅速，已開發(fā)出全蠶粉［12－13］、蠶蛹罐頭［14］、復(fù)合氨基酸口服液［15］、蠶蛹精油、蠶蛹油軟膠囊、食品級蠶蛹蛋白粉、蠶蛹蛋白硬膠囊、雄蠶蛹蛋白硬膠囊［16－17］等功能性食品。迄今為止，對于家蠶不同發(fā)育階段、不同蟲態(tài)膽固醇含量未見報道。因此，本研究采用高效液相色譜法，測定871原種家蠶不同發(fā)育階段、不同蟲態(tài)膽固醇含量，為家蠶類食品的合理開發(fā)與利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

家蠶 871原種，各蟲態(tài)(蠶卵、五齡幼蟲、蠶蛹、成蟲)及各發(fā)育階段家蠶均由安康市蠶桑研究所提供，蠶卵取3g，其它材料每次取20頭，稱鮮重后在80℃下烘至無水恒重，粉碎，備用;甲醇、無水乙醇 色譜純，天津市科密歐化學試劑公司;無水乙醚、石油醚和氫氧化鉀 分析純，天津市天利化學試劑公司;膽固醇標準品(純度99.7%)中國藥品制品鑒定所。

高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器 美國Waters公司;C18(5μm，250mm ×4.6mm)液相色譜柱美國迪馬公司;磁力攪拌加熱電熱套 上海雷磁新涇儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:C18(5μm，250mm×4.6mm);柱溫:38℃;流動相:甲醇;流速:1.0mL/min;紫外檢測波長:205nm。

1.2.2 標準溶液的制備 準確稱取膽固醇標準品50.00mg，溶于少量甲醇中，甲醇定容至50mL棕色容量瓶中，制得膽固醇儲備液(濃度1.0mg/mL)。吸取此溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL 置于 10mL 容量瓶中，甲醇定容，制成膽固醇標準使用液(濃度分別為為 0.100、0.200、0.300、0.400、0.500mg/mL)。

1.2.3 家蠶樣品前處理

1.2.3.1 皂化 稱取研磨均勻的樣品0.5000g于250mL平底燒瓶中，加入30mL無水乙醇，10mL 60%氫氧化鉀溶液，混勻后100℃磁力攪拌加熱回流1h。皂化結(jié)束后，用5mL無水乙醇自冷凝管頂端沖洗其內(nèi)部，取下燒瓶冷卻至室溫。

1.2.3.2 提取 轉(zhuǎn)移全部皂化液于250mL分液漏斗中，用30mL蒸餾水洗滌燒瓶三次，再用40mL無水乙醇和石油醚(1∶1)沖洗三次，合并沖洗液與皂化液，振蕩2min，靜置分層。轉(zhuǎn)移水相于第二個250mL分液漏斗，再用30mL無水乙醇和石油醚(1∶1)提取兩次。合并三次提取液，倒入含有5.0g無水硫酸鈉的燒杯中，將上清液轉(zhuǎn)移到150mL圓底燒瓶中。

1.2.3.3 濃縮 將上述提取液在65℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，乙醇淋洗定量至5mL，0.45mm微孔濾膜過濾，取20.0μL進行色譜測定。標準品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 標準品及樣品的膽固醇色譜圖Fig.1 Chromatogram of cholesterol standard and cholesterol in a sample

1.2.4 樣品檢測限測定 根據(jù)組分響應(yīng)值的不同，在同一樣品中添加3種不同濃度的標準品，按1.2.3進行處理。待HPLC系統(tǒng)完全平衡后，以S/N＞3定為檢測限。

1.2.5 樣品加標回收率測定 在家蠶四種蟲態(tài)中分別添加3種不同濃度的標準品，并以1.2.3的方法進行處理(每個水平重復(fù)3次)，以衡量樣品前處理對目標組分的影響。

1.2.6 膽固醇含量計算公式 X=(C×V)/m

式中:X為樣品中膽固醇含量，mg/g;C為進樣樣品濃度，mg/mL;V為定容體積5.0mL;m為稱取樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

對膽固醇標準溶液進行全波長掃描后確定在205nm處有最大吸收峰，故選擇205nm為檢測波長。

2.2 標準品的分析

在1.2.1的色譜條件下，對5種不同濃度的標準品連續(xù)進樣3次，記錄標品的保留時間、峰高以及峰面積值。結(jié)果表明，組分保留時間、峰高以及峰面積的CV(n=3)均小于0.8%。由此可見，儀器和方法的穩(wěn)定性均比較好。0.5000mg/mL膽固醇標準溶液色譜圖見圖1。

2.3 標準回歸方程

取1.2.2標準使用液，分別取20μL進行色譜測定，以峰面積Y為縱坐標，膽固醇濃度X為橫坐標繪制標準曲線。

方程為:Y=10585X+36833，R2=0.9989

可以看出，標準品的濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均在0.9900以上。因此，采用峰面積定量法對樣品中膽固醇進行定量分析是可行的。

表1 膽固醇回收率實驗結(jié)果Table 1 Results of recovery experiment of cholesterol

2.4 樣品檢測限的確定

采用1.2.4的方法測定家蠶樣品中膽固醇含量的檢測限為0.002mg/mL，完全符合國家檢測限標準的要求。

2.5 樣品加標回收率的測定結(jié)果

按1.2.5的方法，在家蠶4種不同蟲態(tài)中加入3種不同濃度膽固醇標品進行色譜分析，每個重復(fù)三次，以計算各組分的加標回收率，結(jié)果如表1所示?？梢钥闯?，家蠶的4種蟲態(tài)其加標回收率在89.1%～103.2%，平均回收率為 96.5%，相對標準偏差4.65%，在此色譜條件下以3倍信噪比計算檢出限測得本法檢出限為0.002mg/mL。因此，該色譜分析方法對于膽固醇的分析是準確、可信的。

2.6 家蠶不同蟲態(tài)膽固醇含量測定結(jié)果

分別測定蠶卵、幼蟲、蠶蛹、蠶蛾四種蟲態(tài)的膽固醇含量，每種蟲態(tài)重復(fù)三次，取平均值。參照鮮家蠶含水率為70%，計算出100g鮮蠶中膽固醇的含量，檢測結(jié)果見表2。方差分析表明家蠶不同蟲態(tài)膽固醇的含量之間差異性顯著。

表2 家蠶不同蟲態(tài)膽固醇含量Table 2 Determination of cholesterol in different instars of silkworm

表2表明，雌、雄家蠶在幼蟲、蛹期、成蟲三個時期膽固醇含量呈現(xiàn)明顯的增長趨勢，其中在蛹期時，雌、雄家蠶的膽固醇含量基本相等，而在幼蟲和成蟲期雌家蠶的膽固醇含量總是明顯高于雄家蠶。結(jié)果表明鮮家蠶不同蟲態(tài)中膽固醇的含量有所差異，即蠶卵(132.583mg/100g)＞成蟲(100.376mg/100g)＞蛹期(80.428mg/100g)＞幼蟲(55.105mg/100g)。

2.7 家蠶不同發(fā)育階段膽固醇含量測定結(jié)果

從五齡幼蟲期到成蟲期，每隔兩天測定一次家蠶在某一蟲態(tài)(幼蟲、蠶蛹、蠶蛾)下的膽固醇含量，重復(fù)三次，取平均值。參照鮮家蠶含水率為70%，計算出100g鮮蠶中膽固醇的含量，檢測結(jié)果見表3。

表3 家蠶不同發(fā)育階段膽固醇含量Table 3 Determination of cholesterol in different developmental stages of silkworm

圖2表明，雌蠶膽固醇含量在五齡幼蟲期的第6d最低(37.188mg/100g)，第8d最高(117.170mg/100g)，而雄蠶膽固醇含量在五齡幼蟲期的第8d最低(30.077mg/100g)，成蛾后第1d最高(91.698mg/100g);雌蠶膽固醇的含量在幼蟲期、成蟲期均高于雄蠶。在幼蟲期，雌蠶的膽固醇含量呈V型波動，且波動幅度大，雄蠶則一直緩慢下降。進入蛹期，雌蠶的膽固醇含量逐漸下降，雄蠶的膽固醇逐漸升高，然后它們均趨于平穩(wěn)，在蛹期的最后幾天出現(xiàn)小幅度的波動。變成成蟲后雌蠶膽固醇升高，而雄蠶膽固醇降低。在昆蟲體內(nèi)，膽固醇既是細胞膜的主要成分，又是蛻皮激素的前體物質(zhì)，但其自身不能合成，只能從食物中攝取。家蠶從預(yù)蛹期開始便停止進食，即食物來源的膽固醇被切斷，那么從該階段往后到成蟲期膽固醇含量的變化就可能是家蠶體內(nèi)其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化或分解成膽固醇所致。

表4 不同食品中膽固醇含量比較Table 4 Difference of cholesterol in various foods

圖2 家蠶不同發(fā)育階段膽固醇含量的變化Fig.2 Content of cholesterol in different developmental stages of silkworm

2.8 家蠶膽固醇含量與其他食品的比較

由表4可知，蠶蛹膽固醇含量明顯低于雞蛋、河蟹、墨 魚、炸 雞、雞 腿、豬 小 排、肥 牛 肉，為80.428mg/100g。

3 討論與結(jié)論

本文選取的材料871家蠶為中國系統(tǒng)，二化性品種，由57B交C4雜交選育而成，其與872的雜交品種在四川、山東、安徽、陜西、云南等省大量推廣應(yīng)用。本文采用高效液相色譜法測定871家蠶不同蟲態(tài)中膽固醇含量，并對實驗檢測方法及結(jié)果的精密度、準確度進行了討論，測定效果比較理想。分析結(jié)果表明，871家蠶不同蟲態(tài)期膽固醇含量較低，其中蠶卵期的膽固醇含量最高。即蠶卵(132.583mg/100g)＞成蟲(100.376mg/100g)＞蛹期(80.428mg/100g)＞幼蟲(55.105mg/100g)。研究證實，昆蟲缺少膽固醇合成鯊烯合酶和羊毛甾醇合酶等兩種關(guān)鍵酶［18－20］，因此，其只能從食物中攝取膽固醇來滿足機體的正常生長、發(fā)育和繁殖的需要。但本研究顯示成蟲期膽固醇含量比蛹期含量高，但蛹期蠶未攝食，膽固醇來源尚需進一步研究。不同蟲態(tài)下雌雄家蠶膽固醇含量有一定差異，其原因也是本研究下一步進行的方向。

對871家蠶不同發(fā)育階段膽固醇含量研究后，發(fā)現(xiàn)其膽固醇含量的變化沒有明顯的規(guī)律，雌蠶和雄蠶的變化也不具有一致性，因此，我們推測膽固醇含量的變化是由多種因素共同作用所致。我們對實驗結(jié)果作出以下推測性的解釋:在第五齡幼蟲期的前6d，雌雄蠶膽固醇含量均逐漸降低，由于膽固醇是蛻皮激素的前體物質(zhì)［21］，幼蟲化蛹時會合成大量的蛻皮激素，導(dǎo)致膽固醇消耗量增加?；记?，蠶不停地攝食，蛻皮激素合成量已滿足生理需要，不需要更多的膽固醇，所以膽固醇含量增加?；己蠹俺上x期膽固醇含量的變化暫不能做出合理的假設(shè)，有待進一步的研究。

通過對比其他食品中膽固醇含量，發(fā)現(xiàn)蠶蛹膽固醇含量明顯低于雞蛋、河蟹、墨魚、炸雞、雞腿、豬小排、肥牛肉［2］，蠶卵膽固醇含量為132.583mg/100g，低于雞蛋(585mg/100g)［2］。高膽固醇和飽和脂肪食物的大量攝取被認為是誘發(fā)高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病等眾多心血管疾病的重要因素［1］，也有研究證明昆蟲體內(nèi)膽固醇含量極低，是低膽固醇食品的潛在來源［13，22］。因此，高血壓、高血脂等心血管病患者及中老年人可以放心食用家蠶幼蟲、蠶蛹、成蟲食品及保健品。

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