環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測椰毒假單胞菌的研究

馬曉燕，張?zhí)N哲，王 羽，劉 哲，王曉麗，張 偉，*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001;2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院河北保定071000;3.石家莊科技信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北石家莊050081;4.保定科技職業(yè)學(xué)院，河北保定071000)

椰毒假單胞菌(Pseudomonas cocovenenans)主要存在于發(fā)酵的玉米、糯玉米、黃米、高梁米、變質(zhì)銀耳中，是一種導(dǎo)致食物中毒的、致死率極高的病原微生物，該菌引起的食物中毒在國內(nèi)外早有報(bào)道［1－3］。椰毒假單胞菌食物中毒發(fā)病急，癥狀表現(xiàn)復(fù)雜多變，臨床上分腦型、肝型、腎型及混合型四型。由于椰毒假單胞菌食物中毒流行規(guī)模較大、發(fā)病率和病死率極高，而且目前缺乏特效的解毒措施。因此椰毒假單胞菌的檢測方法是否靈敏、快速至關(guān)重要。目前對椰毒假單胞菌的檢測主要采用傳統(tǒng)生理生化和免疫學(xué)方法，例如GB/T4789.29－94(椰毒假單胞菌酵米面亞種的檢驗(yàn))，檢測過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且靈敏度較低［4］。除此以外也有利用薄層層析、高效液相色譜、紫外分光光度、ELISA等方法檢測椰毒假單胞菌所產(chǎn)生的外毒素的。近年來，椰毒假單胞菌的分子檢測方法取得重要進(jìn)展，基于保守序列16S rRNA、23S rRNA以及16S～23S rRNA間區(qū)序列，利用PCR、產(chǎn)物測序分析及脈沖場凝膠電泳等技術(shù)的分子檢測相繼建立［5－7］，但是這些方法絕大多數(shù)都需要昂貴的儀器設(shè)備、繁瑣的電泳過程以及對檢測人員的較高技術(shù)要求等，使其在基層難以普及和推廣。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop－mediated Isothermal Amplification，簡稱LAMP)是2000年由日本的榮研株式會(huì)的Notomi T等［4－5］開發(fā)出來的一種新的核酸擴(kuò)增方法。其特點(diǎn)是針對靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件(65℃左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，具有高特異性和等溫快速擴(kuò)增的特點(diǎn)，近期相關(guān)研究成果表明，LAMP法檢測在各種食源性致病菌方面具有良好的潛力［8－11］。利用 LAMP 技術(shù)檢測椰毒假單胞菌國內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究以椰毒假單胞菌的16S～23S rRNA為靶基因設(shè)計(jì)內(nèi)、外引物，建立LAMP反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，實(shí)現(xiàn)對食品中椰毒假單胞菌的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

椰毒假單胞菌(Pseudomonascocovenenans，NCIB9450)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，CICC21600)、阪 崎 腸 桿 菌 (Enrerobacter sakazaki，ATCC29544)、蠟 樣 芽 孢 桿 菌 (Bacilluscereus，CMCC63302)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，CICC 22945)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans，CICC 20139)、致病性大腸埃希氏菌(Escherichia coli EPEC O78:K80、CICC 10372)、單核增生性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes、CMCC54001)、甲型副傷寒沙門氏菌(Salmonella schottmuelleri、CMCC50001)、普通變形桿菌(Proteus vuLgaris，CMCC49027)、宋 內(nèi) 志 賀 氏 菌 (Shigella sonnei，CMCC51334)以上菌株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)和中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(CMCC)。

銀耳 購自保定當(dāng)?shù)厥袌?氯化鈉、乙醇等其它試劑 均為分析純;LAMP，PCR引物等 購自或合成于上海生工生物工程有限公司;dNTP、DNA Marker 100bp、6 × Loading buffer、MgCl2、TaKaRa Taq DNA ploymerase、10×PCR buffer 大連寶生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;BSTst DNA聚合酶 購自New England Biolabs公司;溴化乙錠(EB)Sigma公司。

PCR擴(kuò)增儀(Whatman T Gradient基因擴(kuò)增儀)德國Biometra公司;恒溫培養(yǎng)箱、凝膠成像系統(tǒng)(BINDA 2020D)北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司;電泳儀(DXY－33A型)北京市六一廠;微量移液器(0.5～10μL、10～100μL，DrgonMed Pipette)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 椰毒假單胞菌的培養(yǎng) 取保藏的椰毒假單胞菌在PDA固體培養(yǎng)基中進(jìn)行斜面劃線，恒溫箱37℃培養(yǎng)18～24h，傳代培養(yǎng)2次。挑取單個(gè)菌落接種于新鮮無菌的液體LB培養(yǎng)基中，37℃120r/min振蕩培養(yǎng)過夜。

1.2.2 椰毒假單胞菌基因組DNA的提取 菌株用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，培養(yǎng)液在10000r/min離心5min，棄去上清，收集菌體。加入500μL 10×TE Buffer洗滌沉淀2次，重懸菌液，加入10%SDS溶液100μL，于 65℃水浴 10min。加入500μL 苯酚/氯仿/異戊醇8000r/min離心10min，以大口徑吸管小心移出上清液;加入等體積的異戊醇/氯仿(1∶24)混勻使之成為乳濁狀，10000r/min，離心1min，取上清。重復(fù)脫蛋白2次，使中間無蛋白層，吸取上層水相。加入25μL乙酸鈉(pH5.2)和500μL預(yù)冷的無水乙醇，上下顛倒混勻，冰浴10min沉淀;14000r/min離心5min，小心吸出上清液，DNA沉淀物自然風(fēng)干后，加入100μL TE緩沖液，4℃?zhèn)溆没颍?0℃保存。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系及反應(yīng)程序 針對椰毒假單胞菌GenBank中(基因號(hào) EF552059)16S～23S rRNA基因序列，運(yùn)用在線引物設(shè)計(jì)軟件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)設(shè)計(jì)LAMP引物(見表1)。引物設(shè)計(jì)原則參照Notomi T［5］。借助RNA Structure軟件對備選引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析、篩選，確定最佳引物。每條引物在基因組中的位置如圖1所示。PCR引物參照文獻(xiàn)［6］(見表2)。

表1 LAMP引物Table 1 Primers of LAMP

圖1 每條引物在基因組中的位置Fig.1 Each primer in the genome of the location.

表2 PCR引物Table 2 Primers of PCR

1.2.3.1 LAMP和PCR反應(yīng)體系 25μL LAMP反應(yīng)體系:內(nèi)引物(FIP和BIP)各3μL，外引物(F3和B3)各 0.5μL，2.5mmol dNTP 4.5μL，25mmol MgCl23μL，10×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，8U的Bst DNA聚合酶大片段，2μL DNA模板和用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。

PCR反應(yīng)體系:為了比較LAMP檢測椰毒假單胞菌靈敏度，進(jìn)行了PCR反應(yīng)，PCR引物見表3。同時(shí)可用LAMP引物的兩條外引物(F3和B3)作為PCR的引物使用。50μL PCR反應(yīng)體系包括:10×聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液(100mmol Tris－HCl(pH8.3)，500mmol(KCl))，25mmol MgCl22μL，2.5mmol dNTP 5μL，上下游引物各 1μL，5U 的 Taq DNA 聚合酶，8μL的DNA模板和用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。

1.2.3.2 LAMP和PCR反應(yīng)程序 LAMP操作程序:首先在62℃水浴鍋中反應(yīng)30min，然后將其放入80℃水浴鍋中，水浴10min終止反應(yīng)，通過肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀。進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察梯形條帶，以證實(shí)是否發(fā)生了LAMP反應(yīng)。PCR操作程序:預(yù)變性 94℃，5min;變性 94℃，30s，退火55℃，30s，延伸 72℃，1min，進(jìn)行 33 個(gè)循環(huán);最終72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié)果與討論

2.1 LAMP引物特異性的研究

從1.1.1所有供試菌株中按1.2.2的方法提取DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增檢測引物特異性，其瓊脂糖凝膠電泳圖如圖2所示。只有椰毒假單胞菌擴(kuò)增出特異性片段，而用純水做模板的陰性對照和其它10株腸道致病菌的擴(kuò)增結(jié)果均顯示為陰性。可見該方法具有較好的特異性。

圖2 LAMP引物特異性的檢測結(jié)果Fig.2 The specificity of the LAMP primers

2.2 椰毒假單胞菌純培養(yǎng)靈敏度的研究

2.2.1 LAMP檢測椰毒假單胞菌的靈敏度 過夜培養(yǎng)的椰毒假單胞菌的菌懸液(濃度為5.4×109CFU/mL)，10倍梯度稀釋菌液，按1.2.3.1和1.2.3.2進(jìn)行LAMP檢測椰毒假單胞菌，測定其靈敏度，結(jié)果如圖3所示。在稀釋到109倍(5.4CFU/mL)時(shí)電泳有梯形條帶。而稀釋到1010倍(5.4×10－1CFU/mL)時(shí)電泳無梯形條帶。即LAMP檢測椰毒假單胞菌的靈敏度達(dá)到5.4CFU/mL。

圖3 LAMP檢測椰毒假單胞菌的靈敏度Fig.3 The sensitivity of LAMP for detection of Pseudomonas cocovenenans in pure cultures by LAMP

2.2.2 PCR檢測椰毒假單胞菌的靈敏度 過夜培養(yǎng)的椰毒假單胞菌的菌懸液(濃度為5.4×109CFU/mL)，10倍梯度稀釋菌液，按1.2.3.1和1.2.3.2進(jìn)行常規(guī)PCR檢測椰毒假單胞菌，測定其靈敏度。結(jié)果如圖4所示:PCR擴(kuò)增得到一條231bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果相符，PCR檢測椰毒假單胞菌的靈敏度為5.4×103CFU/mL。綜上可知，與 PCR相比，LAMP方法檢測椰毒假單胞菌更加靈敏，其靈敏度是PCR的1000倍。

圖4 PCR檢測椰毒假單胞菌的靈敏度Fig.4 The sensitivity for detection of Pseudomonas cocovenenans in pure cultures by PCR

2.3 LAMP檢測人工污染銀耳的檢出限

經(jīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)可知，過夜培養(yǎng)的椰毒假單胞菌的菌懸液濃度為7.6×108CFU/mL，即人工污染銀耳樣品中椰毒酵假單胞菌的原始濃度為7.6×108CFU/g。按試劑盒法處理樣品提取DNA，進(jìn)行LAMP檢測人工污染銀耳中的椰毒假單胞菌的檢出限實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖5所示:利用LAMP方法，從人工污染銀耳樣品中成功地檢測出椰毒酵假單胞菌，檢出限是76CFU/g。

3 結(jié)論

圖5 LAMP檢測人工污染銀耳中椰酵假單胞菌的檢出限Fig.5 The detection limit of LAMP for detection of Pseudomonas cocovenenans of artificially tremella sample.

LAMP作為一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，它針對靶序列的6個(gè)特定區(qū)域設(shè)計(jì)引物，借助具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下就可以擴(kuò)增核酸，既保證了擴(kuò)增的特異性，也提高了擴(kuò)增效率。它的擴(kuò)增產(chǎn)物是由多重復(fù)靶序列的莖環(huán)狀DNA和花椰菜狀DNA組成，因此瓊脂糖凝膠電泳后會(huì)呈現(xiàn)特有的典型的階梯狀條帶。此外，在擴(kuò)增形成大量核酸時(shí)，從dNTPs中析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)體系中的Mg2+結(jié)合，還可產(chǎn)生肉眼可見的白色焦磷酸鎂沉淀，從而使結(jié)果鑒定簡單化，省略電泳過程，提高檢測速度。

本研究針對椰毒假單胞菌16S～23S rRNA基因序列在線設(shè)計(jì)了LAMP引物，建立了快速檢測椰毒假單胞菌的LAMP檢測體系，靈敏度為5.4CFU/mL;與傳統(tǒng)PCR方法相比較，LAMP方法檢測靈敏度是常規(guī)PCR的1000倍，且將整個(gè)檢測時(shí)間縮短為2h;LAMP方法檢測人工污染銀耳產(chǎn)品中椰毒假單胞菌的檢出限為76CFU/g。綜上所述，本研究建立的LAMP快速檢測椰毒假單胞菌方法，具備靈敏度高，耗時(shí)短，特異性強(qiáng)，方法簡便，費(fèi)用低等特點(diǎn)且儀器要求簡單，便于在基層推廣，具有很好的應(yīng)用前景。

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