鵝血紅蛋白抗氧化活性肽的制備及工藝研究

布冠好，姬莉莉，王琳珍，張藝帆，李開南，李 梵，趙曉丹

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001)

畜禽血液作為食品加工的副產(chǎn)物之一，其資源豐富，且含有大量的蛋白質(zhì)，營養(yǎng)價值較高。其應(yīng)用較多的是部分做成血粉或血豆腐等初級產(chǎn)品或作為飼料原料，而大部分畜禽血液被直接排放丟棄，不僅造成了蛋白資源的流失，而且也嚴重污染了環(huán)境。目前，以動物和植物為來源的生物活性肽產(chǎn)物被廣泛研究，加工血紅蛋白制備生物活性肽不但可以充分利用血液中大量寶貴的蛋白質(zhì)，而且有助于環(huán)境的保護。我國對畜禽血液的研究主要集中在豬血、牛血和鴨血上，對鵝血產(chǎn)品的研究很少。因此，開展鵝血產(chǎn)品深加工的研究具有重要意義。據(jù)報道，關(guān)于鵝血的研究目前主要集中在醫(yī)學(xué)方面，其中鵝血的抗癌效果顯著，鵝血具有增強機體免疫力的功能，對食道癌、上呼吸道癌、肝癌等具有良好的功效［1－2］。雖然近年來有關(guān)酶解血紅蛋白制備生物活性肽方面的研究取得了許多突破，國內(nèi)外已有報道利用雞血紅蛋白、豬血紅蛋白來制備抗氧化肽［3－6］，國內(nèi)有少量相關(guān)鵝血紅蛋白水解肽制備工藝的研究［7－8］，但關(guān)于鵝血紅蛋白抗氧化活性肽還未見報道。本文以新鮮鵝血為原料分離血紅蛋白，采用蛋白酶水解鵝血紅蛋白制備抗氧化活性肽，并利用正交實驗確定最佳酶解條件，從而為鵝血在食品及保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鵝血 鄭州市廣田鵝業(yè)，郎德鵝;堿性蛋白酶(酶活9252U/g)、中性蛋白酶(酶活18803U/g)、風味蛋白酶(酶活3839U/g)丹麥諾維信公司;DPPH自由基 Sigma公司;維生素C 鄭州錦德化工食品添加劑有限責任公司;TBHQ 進口分裝，分析純;福林試劑、甲醛、檸檬酸三鈉、氫氧化鈉、無水乙醇等 均為國產(chǎn)分析純。

GL－20C高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;KQ－300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;TGJ－18型冷凍干燥機 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;TU－1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;pH211臺式酸度測定儀北京哈納科儀科技有限公司;分析天平 北京賽多利斯天平有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鵝血紅蛋白的制備 新鮮鵝血加入適量食用級抗凝劑，充分攪拌并離心(8000r/min)分離，將下層血細胞用生理鹽水洗滌，收集沉淀的血細胞加入適量蒸餾水，用超聲波清洗儀處理，破壞細胞壁，離心(4000r/min)后上層為血紅蛋白，下層為細胞膜及雜質(zhì)，取上層血紅蛋白溶液進行冷凍干燥，即得血紅蛋白粉。經(jīng)微量凱氏定氮法測定血紅蛋白粉中蛋白含量為84.8%。

1.2.2 鵝血紅蛋白的酶解 稱取一定量的血紅蛋白粉，按5%(w/v，蛋白濃度)將其配成水溶液，在水浴鍋中加熱至所需要的溫度，并調(diào)節(jié)至所需pH。然后加入蛋白酶進行水解。水解在恒溫水浴鍋中進行，水解過程中不斷加入1mol/L NaOH或1mol/L HCl以維持pH在規(guī)定的范圍內(nèi)(上下相差不超過0.1)。到設(shè)定時間后，將反應(yīng)體系在100℃保持10min使酶失活，將水解物4000r/min冷凍離心10min，取上清液進行指標檢測。工藝路線如下:

血紅蛋白→溶解水中配成溶液(底物蛋白濃度為5%)→水浴加熱至所需溫度→用1mol/L NaOH或1mol/L HCl調(diào)pH→加酶水解→加熱鈍化酶(沸水浴10min)→4000r/min離心10min→取上清液檢測

1.2.3 指標測定

1.2.3.1 蛋白含量測定 采用微量凱氏定氮法，參照GB/T 5009.5－2003。

1.2.3.2 酶活測定 采用福林－酚法［9］。

1.2.3.3 水解度測定 甲醛滴定法［10－11］。

1.2.3.4 抗氧化活性測定 檢測DPPH自由基清除能力。DPPH自由基是一種相當穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液在517nm下有強吸收。DPPH自由基清除率測定參照Yen和Hsieh［12］的方法，并略做修改。取鵝血紅蛋白水解液(40mg蛋白/mL蒸餾水中)1mL及4mL(1×10－4mol/L)DPPH自由基溶液，在室溫下避光靜置30min。在517nm波長下測這種反應(yīng)的吸光值，吸光值越低，體系清除DPPH自由基能力越強。根據(jù)下列公式計算水解液對DPPH自由基的清除率:

式中:A1為加水解液后DPPH溶液的吸光度;A2為水解液的吸光度;A3為未加水解液時DPPH溶液的吸光度。

1.2.4 不同蛋白酶對產(chǎn)物抗氧化活性的影響 利用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶分別在各自的最適溫度和pH下，酶與底物比為6000U/g，酶解鵝血紅蛋白6h后，100℃下水浴10min，滅酶，4000r/min離心10min，取上層清液測定其抗氧化活性。

1.2.5 酶解條件對鵝血紅蛋白水解液的影響

1.2.5.1 酶解溫度的影響 取鵝血紅蛋白底物濃度為5%，酶與底物比為6000U/g，pH為7.5，分別在40、45、50、55、60℃下，水解6h 后滅酶，取酶解液測其水解度和抗氧化活性。

1.2.5.2 酶解時間的影響 取鵝血紅蛋白底物濃度為5%，酶與底物比為6000U/g，pH為7.5，溫度為50℃，分別水解4、6、8、10、12h 后滅酶，取酶解液測其水解度和抗氧化活性。

1.2.5.3 pH的影響 取鵝血紅蛋白底物濃度為5%，溫度為50℃，酶與底物比為6000U/g，取pH分別在6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，水解 6h 后，取酶解液測其水解度和抗氧化活性。

1.2.5.4 酶與底物比的影響 取鵝血紅蛋白底物濃度為5%，pH為7.5，溫度為50℃，分別在酶與底物比為 2000、4000、6000、8000、10000U/g 條件下，水解 6h后，取酶解液測其水解度和抗氧化活性。

1.2.6 酶解條件的優(yōu)化 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用L9(34)正交表進行正交實驗設(shè)計，對合適的酶解條件進行優(yōu)化，以期獲得抗氧化活性較高的鵝血紅蛋白酶解產(chǎn)物。正交實驗因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.7 酶解產(chǎn)物抗氧化性與TBHQ及維生素C(VC)的比較 將鵝血紅蛋白水解產(chǎn)物與合成抗氧化劑TBHQ及VC的抗氧化性進行比較，測定它們之間抗氧化活性的差異。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 本研究所有實驗數(shù)據(jù)重復(fù)測定三次，結(jié)果用平均值±標準差(mean±SD)表示。采用SAS8.2分析軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶對鵝血紅蛋白水解液抗氧化活性的影響

不同類型的蛋白酶水解蛋白的能力和作用位點不同，因此水解度及酶解產(chǎn)物的特性也有較大的差異。對于原料鵝血紅蛋白，其沒有水解時對DPPH自由基的清除率為25.7%。由圖1可知，三種蛋白酶中，中性蛋白酶水解鵝血紅蛋白獲得的水解液對DPPH自由基的清除作用最強，故選中性蛋白酶作為最佳用酶進行后續(xù)研究。

2.2 酶解溫度對鵝血紅蛋白水解液的影響

圖1 不同蛋白酶對DPPH自由基清除率的作用Fig.1 Effect of different protein enzymes on the DPPH free radical scavenging rate

溫度對水解液的影響如圖2所示。由圖2可知，隨著溫度升高，鵝血紅蛋白的水解度在初始階段逐漸增大，在50～55℃時水解度趨于平緩，55℃后，水解度明顯下降，可能由于較高的溫度導(dǎo)致了部分蛋白酶的失活，從而使酶解反應(yīng)速度下降，水解度降低［13］。因此，中性蛋白酶在 45～55℃ 時水解效果較好。

圖2 溫度對水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of temperature on degree of hydrolysis and the DPPH free radical scavenging rate

隨著溫度的升高，鵝血紅蛋白水解產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力也逐漸增強，50℃時達到最高水平(p＜0.05)，之后清除DPPH自由基的能力降低。結(jié)合溫度對水解度的影響，較適宜的酶解溫度為45～55℃。

2.3 酶解時間對鵝血紅蛋白水解液的影響

酶解時間對水解液的影響見圖3。由圖3可知，鵝血紅蛋白的水解度隨著水解時間的延長而增加;從8h開始，水解度呈緩慢增長趨勢。這可能是由于蛋白酶的活力隨著酶解時間的延長而逐漸降低。

圖3 酶解時間對水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of time on degree of hydrolysis and the DPPH free radical scavenging rate

此外，隨著酶解時間的延長，水解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除作用也顯著增強，這可能是隨著水解度的增加，產(chǎn)生了更多分子量較小的肽段，而這些肽段所含的氨基酸殘基具有較高清除自由基的能力;從10h開始清除率增長緩慢。因此，清除DPPH自由基能力較強的酶解時間是8～12h。

2.4 pH對鵝血紅蛋白水解液的影響

pH對水解液的影響見圖4。溶液pH的改變會影響蛋白酶的解離狀態(tài)及酶與底物的親和力，從而影響酶解反應(yīng)及酶解產(chǎn)物的性質(zhì)。由圖4可知，當中性蛋白酶在pH7.0和pH7.5的較中性環(huán)境下水解鵝血紅蛋白時，水解度明顯較高(p＜0.05)，說明水解的酶在最適pH范圍內(nèi)。在偏堿性環(huán)境下，水解度明顯下降，水解環(huán)境的堿性越大水解度越低。

圖4 pH對水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of pH on degree of hydrolysis and the DPPH free radical scavenging rate

當中性蛋白酶在 pH7.0、7.5時，酶解液清除DPPH自由基的能力顯著提高(p＜0.05)，這可能與此環(huán)境下鵝血紅蛋白多肽鏈中具有抗氧化活性的疏水性基團的釋放有關(guān)。在偏堿性環(huán)境下，清除率明顯降低。pH在6.5～7.5之間時酶解物抗氧化效果較好。

2.5 酶與底物比對鵝血紅蛋白水解液的影響

酶與底物比對水解液的影響見圖5。由圖5可知，酶與底物比在2000～8000U/g時，血紅蛋白的水解效果隨著酶與底物比的增加，水解度也隨之升高。在大于8000U/g時，水解度基本不變。這可能是由于酶濃度過高時，溶液中的酶將底物全部飽和后，水解程度增加趨緩［13］。

圖5 酶與底物比對水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of enzyme/substrate ratio on degree of hydrolysis and the DPPH free radical scavenging rate

同時，在2000～8000U/g范圍內(nèi)，隨著酶與底物比的升高，水解液清除DPPH自由基的作用也隨之顯著增強(p＜0.05)。當大于8000U/g時，水解液清除自由基能力略有降低。牟雪姣等［4］報道，適當增加酶的添加量可以提高雞血紅蛋白的胃蛋白酶水解物的抗氧化活性。因此，酶與底物比在6000～10000U/g時，水解液清除DPPH自由基能力較好。

2.6 中性蛋白酶酶解條件的優(yōu)化

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇溫度、時間、pH、酶與底物比四個因素，并選擇水解液清除DPPH自由基效果較好的因素水平，進行四因素三水平的正交實驗，以確定中性蛋白酶酶解鵝血紅蛋白的最佳工藝條件。正交實驗結(jié)果見表2。

表2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Arrangement and results of orthogonal test

表3 不同濃度的水解產(chǎn)物、TBHQ、VC抗氧化能力比較Table 3 Antioxidant capacities of goose hemoglobin hydrolysates，TBHQ and ascorbic acid at different concentrations

由表2可知，極差大小 RC＞RA＞RD＞RB，四個因素對DPPH自由基的清除作用大小依次為pH＞溫度＞酶與底物比＞時間。從均值結(jié)果來看，最佳工藝參數(shù)組合為 A2B1C2D2，即取溫度50℃，時間8h，pH7.0，酶與底物比為8000U/g。由于最佳工藝參數(shù)組合并未出現(xiàn)在正交表中，因此用最佳組合進行平行實驗三次，測得在最佳條件下的DPPH自由基清除率為89.6%。

2.7 水解產(chǎn)物、TBHQ及維生素C的抗氧化性比較

鵝血紅蛋白水解液的抗氧化活性與TBHQ及維生素C(VC)進行比較，其結(jié)果見表3。

由表3可知，鵝血紅蛋白酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基能力隨著蛋白濃度的增大而增加。TBHQ和VC清除DPPH自由基能力也隨著濃度的增大而增強。其中20mg/mL蛋白濃度酶解物的自由基清除率與0.1mg/mL的 TBHQ相當，且高于0.5mg/mL的 VC。提示鵝血紅蛋白酶解物可作為氫供體終止自由基鏈式反應(yīng)，表明其具有作為天然抗氧化劑的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

鵝血紅蛋白抗氧化肽制備的最佳用酶為中性蛋白酶。由正交實驗可知鵝血紅蛋白抗氧化肽的酶解因素影響大小順序為:pH＞溫度＞酶與底物比＞時間。中性蛋白酶的最佳酶解工藝參數(shù)組合為:溫度50℃，時間8h，pH7.0，酶與底物比8000U/g。在最佳條件下，水解物對DPPH自由基清除率為89.6%。

鵝血紅蛋白的中性蛋白酶水解液具有較強的抗氧化活性，在一定濃度下清除DPPH自由基的能力大于TBHQ和VC，其有望成為有效的天然抗氧化劑應(yīng)用于食品工業(yè)或作為自由基消除劑用以抑制脂質(zhì)氧化。此外，對鵝血紅蛋白抗氧化肽的氨基酸組成分析將有助于探討其抗氧化機理。

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