釀酒葡萄中內(nèi)生霉菌的分離與初步鑒定

時(shí)永杰，祁付云，安 婷，劉 婭

(石河子大學(xué)食品學(xué)院特色果蔬研究中心，新疆石河子 832003)

內(nèi)生菌廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)和種子等組織細(xì)胞或細(xì)胞間隙，它們?cè)谥参矬w中相互作用，維持微生態(tài)平衡。已有研究表明內(nèi)生菌具有多種生物學(xué)功能，能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，植物內(nèi)生真菌不僅能產(chǎn)生抗癌的活性物質(zhì)［1－5］，還可以產(chǎn)生黃酮、生物堿、萜類(lèi)、甾類(lèi)、醌類(lèi)、環(huán)肽、脂肪酸等化合物，這些化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、殺蟲(chóng)、降糖的功能［6］。新疆處于中國(guó)西北邊陲，釀酒葡萄品質(zhì)優(yōu)良，生物活性成分豐富。目前尚未見(jiàn)對(duì)其中內(nèi)生真菌的研究報(bào)道，因此有必要對(duì)新疆釀酒葡萄中的內(nèi)生菌進(jìn)行分離純化，從而為了解新疆釀酒葡萄中內(nèi)生菌的多樣性，探明內(nèi)生菌與宿主植物相同或相似產(chǎn)生物活性物質(zhì)的能力，為進(jìn)一步探討內(nèi)生菌與宿主植物的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒葡萄 分別于2011年5、8、10月在新疆石河子天珠葡萄酒廠葡萄園，選取3區(qū)和4區(qū)之間的釀酒葡萄品種“赤霞珠”，取春夏秋三個(gè)季節(jié)葡萄植株的根、莖、葉及果實(shí)的健康組織;葡萄糖、蔗糖、七水合硫酸鎂、硝酸鉀、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、硫酸銨、磷酸氫二鉀、氯化鈣、氯化鐵、碳酸鈣、硫酸鋅、乙醇、次氯酸鈉 均購(gòu)于天津永晟精細(xì)化工有限公司，分析純;瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，化學(xué)純;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)［7］馬鈴薯200g、葡萄糖 20g、瓊脂 20g、蒸餾水 1000mL、pH 自然;延胡索酸發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖100g、七水合硫酸鎂10g、磷酸二氫鉀15g、硫酸銨3.0g、磷酸氫二鉀0.15、氯化鈣0.10g、氯化鐵痕跡、碳酸鈣 30～50g、蒸餾水1000mL、121℃滅菌20min;乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖150g、七水合硫酸鎂0.25g、硫酸鋅0.44g、磷酸二氫鉀0.3～0.6g、尿素 0.522g、蒸餾水 1000mL、121℃滅菌20min。

BS224－S萬(wàn)分之一天平 美國(guó) Mettler Toledo公司;BCD－265F冰箱 榮事達(dá)集團(tuán);LAC－5040S全自動(dòng)高壓滅菌鍋 韓國(guó)LabTech公司;CX21光學(xué)顯微鏡 Olympus公司;SW－CJ超凈工作 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SPX生化培養(yǎng) 寧波市江南儀器廠;SP－752型紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;DK－98－1恒溫水浴鍋 天津泰斯儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

樣品采集→表面消毒→組織塊接種培養(yǎng)→內(nèi)生霉菌分離純化→形態(tài)觀察→生理生化測(cè)定→初步鑒定

表2 內(nèi)生霉菌在PDA平板上的菌落特征Table 2 Characterisitics of endogenous mould colony in the PDA plate

1.2.1 樣品采集 采集3區(qū)和4區(qū)之間健康赤霞珠的根、莖、葉及果實(shí)組織，剪下后立即用保鮮膜包好，置于無(wú)菌袋中，放入冰箱中4℃下保藏。

1.2.2 樣品的表面消毒［8－10］樣品用自來(lái)水沖洗干凈、瀝干，先用5%乙醇浸泡3min、再用10%次氯酸鈉浸泡15～30s進(jìn)行樣品的表面消毒，最后用無(wú)菌水沖洗4遍。各樣品消毒后分別取最后一次沖洗的無(wú)菌水做空白實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證表面消毒效果。

1.2.3 內(nèi)生霉菌的分離純化［11］組織塊培養(yǎng) 取消毒后的根和莖用無(wú)菌刀片將其切成約1.5cm長(zhǎng)的塊，接種時(shí)將暴露出來(lái)的內(nèi)側(cè)組織切面緊貼PDA培養(yǎng)基上;消毒后的葡萄用無(wú)菌刀片切開(kāi)后按上述方法培養(yǎng);消毒后的葉片置于無(wú)菌研缽中研磨，用無(wú)菌鑷子取葉片碎渣接種于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基置于28℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5d。觀察效果，挑取緊貼組織塊邊緣生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.4 葡萄內(nèi)生霉菌的初步鑒定［12］將純化得到的內(nèi)生霉菌進(jìn)行三點(diǎn)培養(yǎng)和載玻片培養(yǎng)，并使用扦片法，通過(guò)菌落形態(tài)的觀察和顯微特性的觀察，進(jìn)行初步鑒定。

1.2.5 生理生化指標(biāo)的測(cè)量方法［13］測(cè)量碳源氮源對(duì)生長(zhǎng)速率方法:以完全培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將缺少碳源、氮源的培養(yǎng)基分別盛入100mL三角瓶中，每瓶30mL，每組兩瓶，標(biāo)記，121℃滅菌20min。冷卻后接入內(nèi)生霉菌孢子。30℃培養(yǎng)一周，用烘干至恒重的濾紙將培養(yǎng)物過(guò)濾，然后將濾得的培養(yǎng)物與濾紙?jiān)?0℃烘干，再升至100℃，烘干至恒重。以完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)物做對(duì)照，將完全培養(yǎng)基中濾得培養(yǎng)物連同濾紙的恒重重量，減去濾紙重量作為100%，以求其他培養(yǎng)基的培養(yǎng)物重量百分比，比數(shù)越小，說(shuō)明缺乏的該成分對(duì)內(nèi)生霉菌的生長(zhǎng)發(fā)育越重要。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生霉菌的分離純化

對(duì)新疆釀酒葡萄“赤霞珠”春夏秋三個(gè)季節(jié)的根、莖、葉及果實(shí)進(jìn)行組織塊培養(yǎng)，將得到的內(nèi)生霉菌進(jìn)行分離純化，得到的菌株數(shù)見(jiàn)表1。

由表1可以看出，從釀酒葡萄中共分離到24株內(nèi)生霉菌，同一季節(jié)赤霞珠不同生長(zhǎng)部位存在的內(nèi)生霉菌數(shù)量和同一生長(zhǎng)部位在不同季節(jié)存在的內(nèi)生霉菌的數(shù)量有很大差異?？傮w上看，赤霞珠不同季節(jié)的內(nèi)生霉菌的數(shù)量占總數(shù)量的比:夏季(20.8%)＜春季(33.3%)＜秋季(45.8%);赤霞珠不同生長(zhǎng)部位的內(nèi)生霉菌數(shù)量占總數(shù)量的比:果實(shí)(12.5%)＜莖(20.8%)＜根(29.2%)＜葉(37.5%)。

表3 內(nèi)生霉菌菌落顯微形態(tài)Table 3 Microscopy of endogenous mould colony

表1 菌種的分布Table 1 The distribution of bacteria

由于在內(nèi)生菌分離過(guò)程中，內(nèi)生菌的數(shù)量和種類(lèi)常受到材料的品種、來(lái)源、分離部位、分離方法、培養(yǎng)基成分、表面消毒程度以及培養(yǎng)條件等諸多因素的影響，選擇適宜的方法可以分離到盡可能多的菌株。由分離結(jié)果可知，利用組織塊法僅從葡萄夏季的葉片中分離得到0株內(nèi)生霉菌，可能是由于表面消毒處理過(guò)度，導(dǎo)致葉片組織內(nèi)的絕大部分微生物都被殺死之故。

2.2 內(nèi)生霉菌的初步鑒定

2.2.1 內(nèi)生霉菌的菌落形態(tài) 通過(guò)對(duì)24株內(nèi)生霉菌進(jìn)行三點(diǎn)培養(yǎng)，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可以看出，分離出的24株赤霞珠內(nèi)生霉菌的菌落形態(tài)存在一定差異。在春、夏、秋三個(gè)季節(jié)分離出的菌株的菌落形態(tài)有一定的相似性，如墨綠色毛毯狀菌株和綠色粉粒狀菌株;根、莖、葉和果實(shí)中均分離出墨綠色地毯狀，說(shuō)明它在赤霞珠中是普遍存在的;根、莖、葉中均分離出黑色沙粒狀菌株，根和莖中均分離出深綠色粉粒狀菌株。而有些菌株菌落形態(tài)與其它的完全不同，如X－P－4的菌絲直立生長(zhǎng)，Q－Y－3－5菌落呈喇叭狀，這些都是不常見(jiàn)的霉菌性狀，這些結(jié)果表明一些內(nèi)生霉菌可能具有一定的組織專(zhuān)化性。

2.2.2 內(nèi)生霉菌的顯微形態(tài)及生化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 由于真菌的屬種眾多，無(wú)法對(duì)24株內(nèi)生霉菌逐個(gè)鑒定到屬，因此挑選兩株具有代表性且產(chǎn)多酚能力較強(qiáng)的菌株 C－2－J－6和 C－1－G－3進(jìn)行顯微形態(tài)觀察，內(nèi)生霉菌菌落顯微形態(tài)見(jiàn)表3，內(nèi)生霉菌生化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

由表3可以看出C－2－J－6的顯微形態(tài)為無(wú)色的無(wú)隔菌絲，孢囊梗直立，沒(méi)有假根，多次分枝，分枝頂端膨大，上生小梗，圓形孢子同時(shí)成熟排列成鏈狀，形似一串“分生孢子”;C－1－G－3的顯微形態(tài)為無(wú)色的有隔菌絲，菌絲垂直生出分生孢子梗，頂端不膨大，無(wú)頂囊，經(jīng)多次分枝，產(chǎn)生幾輪對(duì)稱(chēng)或不對(duì)稱(chēng)小梗，小梗頂端產(chǎn)生分生孢子，總體像“掃帚狀”。

表4 生化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表Table 4 The data of biochemical tests

通過(guò)對(duì) C－2－J－6和 C－1－G－3 進(jìn)行產(chǎn)多酚能力測(cè)定得出:C－2－J－6 在 28℃、pH 為 5.5、接種量達(dá)到6%、培養(yǎng)54h，于765nm下測(cè)其吸光度值，可達(dá)到0.5578;C－1－G－3在 30℃、pH 為 4.8、接種量達(dá)到8%、培養(yǎng) 48h，于 765nm下測(cè)其吸光度值達(dá)到 0.6197［14］。

通過(guò)菌落形態(tài)和顯微形態(tài)，結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》，確定兩株能產(chǎn)多酚的內(nèi)生霉菌［15－16］分別是:C－2－J－6 屬于真菌門(mén)(Fungi)藻菌綱(Phycomyeetes)毛霉目(Mucorales)頭珠霉科(Piptoeephalidaceae)星珠霉屬(Syncephalastrum Schroter);C－1－G－3屬于真菌門(mén)(Fungi)子囊菌綱(Ascomycetes)真子囊菌亞綱(Euascomycetes)曲霉目(Eurotisles)曲霉科(Eurotiaceae)青霉屬(Penicillum)。

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)對(duì)健康無(wú)病害的赤霞珠的根、莖、葉、果實(shí)組織表面消毒后，進(jìn)行組織塊培養(yǎng)，分離純化得到24株內(nèi)生霉菌;不同季節(jié)、不同生長(zhǎng)部位分離出的內(nèi)生霉菌的數(shù)量關(guān)系為:夏季(20.8%)＜春季(33.3%)＜秋季(45.8%)，果實(shí)(12.5%)＜莖(20.8%)＜根(29.2%)＜葉(37.5%)。

3.2 通過(guò)對(duì)C－2－J－6和 C－1－G－32株菌進(jìn)行產(chǎn)多酚能力的測(cè)定可以得出C－1－G－32產(chǎn)多酚的能力高于 C－2－J－6。

3.3 通過(guò)菌落形態(tài)及顯微形態(tài)對(duì)兩株具有多酚生產(chǎn)能力的內(nèi)生霉菌進(jìn)行初步鑒定:C－2－J－6屬于真菌門(mén)(Fungi)藻菌綱(Phycomyeetes)毛霉目(Mucorales)頭珠霉科 (Piptoeephalidaceae)星珠霉屬(Syncephalastrum Schroter);C－1－G－3屬于真菌門(mén)(Fungi)子囊菌綱(Ascomycetes)真子囊菌亞綱(Euascomycetes)曲霉目(Eurotisles)曲霉科(Eurotiaceae)青霉屬(Penicillum)。

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