明串珠菌SK24.002發(fā)酵制備水溶性多糖的初步研究

白愛娟，繆 銘，張 濤，江 波

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇無錫214122)

近年來，老齡化以及與飲食相關(guān)的一些疾病如糖尿病、冠心病、某些癌癥等已經(jīng)成為世界性的公共問題。水溶性多糖(water－soluble polysaccharide，WSP)因具有抗氧化性［1］、抗癌［2］、免疫活性［3－4］、低升糖指數(shù)［5－6］等多種生理功能，越來越受到關(guān)注。水溶性多糖是食品、藥品以及化妝品的重要組成成分，一般利用熱水、熱NaOH溶液或酸溶液從大量的藥用植物、真菌中提取，得率一般小于15%。灰樹花多糖具有增強(qiáng)免疫力、穩(wěn)定血壓、降低血糖的功能，優(yōu)化其提取工藝后多糖的得率達(dá)到13.4%［7］。孫元林等［8］人從當(dāng)歸中提取的水溶性多糖具有保護(hù)白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的功能，提取率為10.8%。而蔣劍平［9］對白花蛇舌草水溶性多糖提取工藝優(yōu)化后，多糖得率僅為6.72mg/g。與傳統(tǒng)提取工藝相比，利用發(fā)酵工程及酶工程能夠更有效、更經(jīng)濟(jì)的從細(xì)菌、酵母中獲得大量的水溶性多糖。作者此前從泡菜中篩選獲得了一株水溶性多糖產(chǎn)生菌，本文在此基礎(chǔ)上利用該菌生產(chǎn)水溶性多糖并研究了該水溶性多糖的分子量分布以及影響其發(fā)酵制備的主要因素。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

明串珠菌SK24.002 保藏于江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室;MRS培養(yǎng)基 稱取酪蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母粉5.0g、葡萄糖5.0g溶于1L蒸餾水中，溶解均勻，后加入乙酸鈉5.0g、檸檬酸二胺2.0g、吐溫80 1.0mL、K2HPO42.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O 0.05g，調(diào)節(jié) pH 至 6.8，高壓滅菌20min。固體培養(yǎng)基加入15.0g/L的瓊脂粉;基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)蔗糖 100、酵母粉 10、K2HPO410.0、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·H2O 0.05，pH6.8;乳糖、半乳糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、苯酚(重蒸餾試劑)、濃硫酸、無水乙醇 均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品:Dextran T－2000(MW2，000，000)、Dextran T－150(MW150，000)、Dextran T－25(MW25，000)、Dextran T－5(MW5，000)Sigma公司。

CL－40M全自動蒸汽滅菌鍋 日本ALP公司;Centrifuge 5804R離心機(jī) 德國 Eppendorf公司;Agilent 1100型高效液相色譜儀 配置RI101型示差折光檢測器，美國Agilent公司;Waters 600E高效液相色譜儀 配置Waters 600四元輸液泵、2410示差折光檢測器、7725i進(jìn)樣閥、Empower2色譜工作站，美國Waters公司;722E型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng):將甘油管保藏的菌種劃線于MRS平板，28℃培養(yǎng)至長出單菌落。挑取單菌落接種到MRS液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)至菌液渾濁。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):按5%的接種量將種子液接入到100mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，160r/min，28℃恒溫振蕩培養(yǎng)48h。

1.2.2 菌重的測定 發(fā)酵一定時間后取50mL的發(fā)酵液離心(10000r/min，10min)，上清液備用，菌體用蒸餾水洗滌三次后置于105℃烘箱中烘干至恒重，測量菌重。

1.2.3 水溶性多糖的提取及含量測定 取等量的無水乙醇(－20℃)與發(fā)酵上清液混勻，離心(10000r/min，10min)，蒸餾水復(fù)溶沉淀，同樣方法洗滌3次，最后用蒸餾水復(fù)溶沉淀得到水溶性多糖溶液，冷凍干燥后得到水溶性多糖粉末，于干燥皿中保藏。取一定體積的水溶性多糖溶液稀釋到合適倍數(shù)后，采用苯酚硫酸法測定水溶性多糖的含量［10］。利用單因素實(shí)驗考察不同碳源、碳源濃度、氮源、氮源濃度、接種量、初始pH、培養(yǎng)溫度、裝液量對水溶性多糖發(fā)酵制備的影響。

1.2.4 水溶性多糖分子量分布測定 采用高效體積排阻色譜法(HPSEC)測定水溶性多糖的分子量分布［11］。測定條件:色譜柱 UltrahydrogelTMLinear柱(300mm×7.8mmid×2)，柱溫45℃，流動相0.1mol/L NaNO3溶液，流速0.9mL/min，試樣5mg/mL水溶性多糖溶液，過0.45μm的纖維素濾膜。將不同分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品配成3mg/mL的溶液，分別進(jìn)樣。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣的保留時間及相應(yīng)分子量對數(shù)，由GPC軟件自動做出分子量校正曲線。參照校正曲線，根據(jù)水溶性多樣樣品的保留時間由GPC軟件自動計算出樣品的分子量。

1.2.5 發(fā)酵液中糖組分含量的測定 采用高效液相色譜法(HPLC)測定。色譜條件:Sugar Pak1鈣型陽離子交換柱(6.5mm×300mm)，柱溫85℃，流動相:超純水，流速 0.4mL/min，試樣:發(fā)酵上清液過0.45μm的纖維素濾膜，標(biāo)準(zhǔn)溶液10mg/mL的蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、葡萄糖、甘露糖溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 水溶性多糖的分子量分布

明串珠菌SK24.002在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48h后，按1.2.3的方法提取水溶性多糖，采用HPSEC測定水溶性多糖的分子量分布，結(jié)果如表1所示。明串珠菌SK24.002水溶性多糖相對分子量為2.4×106，與 L.mesenteroides NRRL B－1355產(chǎn)生的交替糖及L.mesenteroides B－512FMCM產(chǎn)生的右旋糖酐分子量接近［12－13］。與右旋糖酐相比其粘度低，易獲得10%的多糖水溶液，水溶液性質(zhì)與交替糖相似，呈現(xiàn)乳青色。這可能與多糖的分子鏈構(gòu)型有關(guān)，在之后的研究中會進(jìn)一步證明。多分散系數(shù)(Mw/Mn)越大表示多糖分子量分布越廣，由Mw/Mn值可知該水溶性多糖分子量分布集中。HPSEC圖譜為一單峰且對稱性良好，也說明明串珠菌SK24.002發(fā)酵產(chǎn)生的水溶性多糖分子量分布較為集中。表明利用明串珠菌SK24.002直接發(fā)酵可以制備較純、分子量分布較為集中的水溶性多糖。

表1 明串珠菌SK24.002水溶性多糖分子量分布Table 1 The molecular weight distribution of WSP produced by Leuconostoc sp.SK24.002

圖1 明串珠菌SK24.002水溶性多糖HPSEC圖Fig.1 Chromatogram of WSP produced by Leuconostoc sp.SK24.002

2.2 營養(yǎng)環(huán)境對水溶性多糖發(fā)酵制備的影響

2.2.1 碳源及其濃度對水溶性多糖制備的影響 在碳原子數(shù)相同的原則下，分別用20g/L的蔗糖、麥芽糖、乳糖，40g/L葡萄糖、果糖，13.3g/L甘油代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源，搖瓶發(fā)酵48h后測定菌重及多糖含量，結(jié)果如表2所示。從表2中可以看出蔗糖作碳源時，水溶性多糖的產(chǎn)量最高，以其他糖類作碳源時，雖然可以獲得較高的菌重但是多糖含量極低，表明明串珠菌SK24.002僅能利用蔗糖產(chǎn)生水溶性多糖，蔗糖可能誘導(dǎo)該水溶性多糖的產(chǎn)生。

分別用 40、60、80、100、120、140、160、180g/L 的蔗糖代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基的蔗糖，搖瓶培養(yǎng)48h，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，隨著蔗糖濃度的增加水溶性多糖的含量急劇增加，達(dá)到160g/L時達(dá)到最高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于植物性水溶性多糖的得率。進(jìn)行顯著性分析發(fā)現(xiàn)，140、160、180g/L的蔗糖濃度對多糖含量的影響無顯著性，從經(jīng)濟(jì)成本考慮選用140g/L的蔗糖濃度。研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖的濃度一般會影響多糖的分子量分布［14］，因此測定了不同蔗糖濃度下水溶性多糖的分子量分布(圖2)，結(jié)果表明高濃度蔗糖條件下水溶性多糖的分子量略低于低濃度蔗糖條件，但是變化不明顯，均在106以上。說明在此蔗糖濃度范圍內(nèi)，該水溶性多糖的分子量不受蔗糖濃度的影響。

表2 碳源對明串珠菌SK24.002發(fā)酵制備水溶性多糖的影響Table 2 Effects of carbon sources on WSP production by Leuconostoc sp.SK24.002

表3 氮源對明串珠菌SK24.002發(fā)酵制備水溶性多糖的影響Table 3 Effect of nitrogen sources on WSP production by Leuconostoc sp.SK24.002

圖2 蔗糖濃度對明串珠菌SK24.002水溶性多糖制備的影響Fig.2 Effect of sucrose concentration on WSP production by Leuconostoc sp.SK24.002

2.2.2 氮源及其濃度對水溶性多糖制備的影響 分別將10g/L不同氮源代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源，搖瓶發(fā)酵48h后，測定菌重及多糖含量。表3表明胰蛋白胨、牛肉膏及復(fù)合氮源作氮源，有利于菌體的生長及多糖的合成，但是采用牛肉膏時產(chǎn)生的水溶性多糖需進(jìn)行脫色處理，因此從成本角度考慮選用復(fù)合氮源，其配比為 1∶1。采用 2.5、5、7.5、10、12.5、15g/L的復(fù)合氮源培養(yǎng)，圖3顯示當(dāng)?shù)礉舛葹?.5g/L時，多糖含量最高，且菌體生長良好。

圖3 氮源濃度對明串珠菌SK24.002水溶性多糖制備的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources concentration on WSP production by Leuconostoc sp.SK24.002

2.3 發(fā)酵條件對水溶性多糖發(fā)酵制備的影響

2.3.1 接種量對水溶性多糖制備的影響 分別取1%、2.5%、5.0%、7.5%、10%的接種量接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，搖床發(fā)酵48h后，測定結(jié)果如圖4所示。接種量在5%時，多糖獲得最大產(chǎn)率。接種量較小時，菌體密度太小，不利于多糖的合成，接種量過大時，菌體生長迅速，初級代謝產(chǎn)物大量合成抑制次級代謝產(chǎn)物的分泌，多糖的合成受到抑制。

圖4 接種量對明串珠菌SK24.002水溶性多糖制備的影響Fig.4 Effect of inoculation on WSP production by Leuconostoc sp.SK24.002

2.3.2 初始pH對水溶性多糖制備的影響 調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的 pH 為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，發(fā)酵48h后，測定菌重及多糖含量。結(jié)果如圖5所示，pH為7.5時，多糖含量達(dá)到最大。

圖5 pH對明串珠菌SK24.002水溶性多糖制備的影響Fig.5 Effect of initial pH on WSP production by Leuconostoc sp.SK24.002

2.3.3 發(fā)酵溫度對水溶性多糖制備的影響 分別在25、28、30、33、35、37℃的條件下，搖瓶發(fā)酵 48h 后，測定菌重及多糖含量，結(jié)果如圖6所示。低溫條件下有利于菌體的生長，但多糖合成受到抑制，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時，多糖含量達(dá)到最大，高溫條件下不利于菌體生長以及多糖合成。溫度對水溶性多糖合成的影響主要取決于溫度對菌體生長以及水溶性多糖合成酶的影響［14］。

2.3.4 溶氧對水溶性多糖制備的影響 在搖瓶培養(yǎng)中常采用裝液量來評價發(fā)酵過程中的溶氧量。在250mL 的三角瓶中分別裝入 50、75、100、125、150mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵48h后，測定菌重及多糖含量，結(jié)果如圖7所示。從圖7中可以看出裝液量為100mL時多糖含量最高。明串珠菌SK14.002在厭氧的條件下更利于生長，但稍微增加發(fā)酵液中的溶氧有利于水溶性多糖的產(chǎn)生，與Raemaekers等［15］報道的L.mesenteroides NRRL B－1355發(fā)酵生交替糖的條件相似。

圖6 發(fā)酵溫度對明串珠菌SK24.002水溶性多糖制備的影響Fig.6 Effect of temperature on WSP production by Leuconostoc sp.SK24.002

圖7 裝液量對明串珠菌SK24.002水溶性多糖制備的影響Fig.7 Effect of volume of medium on WSP production by Leuconostoc sp.SK24.002

2.4 發(fā)酵過程曲線

在上述得到的條件下，連續(xù)發(fā)酵48h，每隔4h取樣測定發(fā)酵液的pH、菌重、多糖含量、其他糖分含量，結(jié)果如圖8所示。從圖8可以看出，發(fā)酵液中僅存在蔗糖以及果糖，沒有其他糖分存在。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，蔗糖逐漸被消耗，菌體量逐漸增加，發(fā)酵液pH下降，多糖、果糖含量增加。菌體增加趨勢與pH下降趨勢保持一致性，這是由于菌體在生長過程中產(chǎn)生了乳酸等有機(jī)酸。多糖及果糖含量增加略滯后于菌體量的增加，表明水溶性多糖的合成集中在菌體生長的對數(shù)期及穩(wěn)定期。水溶性多糖與果糖含量變化趨勢一致，兩者增加量的和略低于蔗糖減少的量，說明培養(yǎng)基中的蔗糖少部分用于菌體生長，剩余部分用于水溶性多糖的形成同時釋放果糖，該水溶性多糖可能為葡聚糖。

發(fā)酵到8h菌體量達(dá)到最大，pH降低到4.0，之后趨于穩(wěn)定，發(fā)酵到20h左右時，水溶性多糖含量達(dá)到51.40g/L。當(dāng)pH降低到5.0以下時嚴(yán)重影響到菌體的生長，使多糖的合成停止，因此，在擴(kuò)大到發(fā)酵罐時，應(yīng)在5h時開始補(bǔ)加NaOH溶液并使pH穩(wěn)定在5.0以上。

3 結(jié)論

圖8 明串珠菌SK24.002發(fā)酵過程曲線Fig.8 Time course of Leuconostoc sp.SK24.002 fermentation

本文研究了明串珠菌SK24.002發(fā)酵制備的水溶性多糖的分子量分布以及發(fā)酵過程中影響交替糖合成的主要因素。利用明串珠菌SK24.002直接發(fā)酵法便可獲得相對分子量為2.4×106、分子量分布集中的水溶性多糖。對其發(fā)酵條件進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖誘導(dǎo)該水溶性多糖的產(chǎn)生，蔗糖的濃度對其分子量影響不大，均在106以上。多糖形成過程中伴隨果糖的釋放，140g/L蔗糖、3.75g/L酵母粉、3.75g/L胰蛋白胨利于水溶性多糖的合成;接種量5%、初始pH7.5、發(fā)酵溫度30℃、裝液量100mL/250mL發(fā)酵到20h時水溶性多糖含量可達(dá)到51.40g/L。利用明串珠菌SK24.002通過發(fā)酵工程的方法制備水溶性多糖，產(chǎn)量高、發(fā)酵時間短，利于工業(yè)化生產(chǎn)。

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