兼性厭氧芽胞桿菌TSH1丁醇代謝途徑中關(guān)鍵酶的檢測

段曉瑞，王根宇，劉宏娟，薛建偉，張建安

1 太原理工大學精細化工研究所，山西 太原 0300242 清華大學核能與新能源技術(shù)研究院，北京 100084

兼性厭氧芽胞桿菌TSH1丁醇代謝途徑中關(guān)鍵酶的檢測

段曉瑞1,2，王根宇2，劉宏娟2，薛建偉1，張建安2

1 太原理工大學精細化工研究所，山西 太原 030024
2 清華大學核能與新能源技術(shù)研究院，北京 100084

段曉瑞, 王根宇, 劉宏娟, 等. 兼性厭氧芽胞桿菌 TSH1丁醇代謝途徑中關(guān)鍵酶的檢測. 生物工程學報, 2013, 29(5):620?629.

Duan XR, Wang GY, Liu HJ, et al. Key enzymes in butanol fermentation by a facultative anaerobeBacillussp. TSH1. Chin J Biotech, 2013, 29(5): 620?629.

傳統(tǒng)的丁醇生產(chǎn)菌均嚴格厭氧，本實驗室分離了一株兼性厭氧的芽胞桿菌TSH1 (Bacillussp. TSH1)，丁醇梭菌具有相似的丁醇代謝通路及產(chǎn)物。通過研究乙醇和丁醇生成途徑中關(guān)鍵酶的活性，分析乙醇脫氫酶、丁醇脫氫酶及丁醛脫氫酶的活性變化與產(chǎn)物生成的關(guān)系。結(jié)果表明，在發(fā)酵初期，3種酶的活性均迅速升高并在21 h前達到最大值，丁醇、乙醇濃度也逐漸增加，乙醇脫氫酶在12 h酶活達到最大值0.054 U/mg，丁醛脫氫酶在21 h酶活達到最大值0.035 U/mg，丁醇脫氫酶則在15 h酶活達到最大值0.055 U/mg。24 h后，3種酶活均開始下降，并維持在較低水平，而這段時間內(nèi)產(chǎn)物濃度仍持續(xù)增長直至發(fā)酵結(jié)束。研究結(jié)果深化了對微生物丁醇代謝機理的認識，并為進一步研究芽胞桿菌丁醇代謝途徑提供參考。

芽胞桿菌TSH1，丁醇發(fā)酵，乙醇脫氫酶，丁醇脫氫酶，丁醛脫氫酶

丁醇是一種極具潛力的新型生物燃料，與乙醇相比較，具有與汽油更為接近的辛烷值和熱值。同時，丁醇具有抗爆性能好、不腐蝕管道、安全性高、和汽油的混合比高等優(yōu)點，可以用于制取酯類、塑料增塑劑，還可用于醫(yī)藥、噴漆以及用作溶劑。在能源和環(huán)境問題日益嚴峻的背景下，由于以上諸多優(yōu)點，一度興盛并衰退的生物丁醇產(chǎn)業(yè)重新引起了各國研究學者和企業(yè)的興趣。

目前，丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum菌種選育和發(fā)酵工藝的改進已經(jīng)取得較大的進步[1]。但目前大部分丁醇發(fā)酵菌株均為嚴格厭氧型，對儀器設備有很嚴格的要求。本實驗室利用梭菌強化培養(yǎng)基，從玉米粉中篩選出一株產(chǎn)丁醇的芽胞桿菌，該菌株可在微氧條件下，以葡萄糖或淀粉為碳源發(fā)酵生成丁醇，代謝過程與丙酮丁醇梭菌的代謝過程基本一致。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (GC-MS) 分析結(jié)果表明，TSH1菌株發(fā)酵液中主要產(chǎn)物為丁醇、乙醇和丙酮，此外，還有少量的乙酸和丁酸。將其原生質(zhì)體進行輻照誘變后，利用梭菌強化培養(yǎng)基篩選出一株丁醇產(chǎn)量較高且遺傳性狀穩(wěn)定的兼性厭氧菌株[2]。

為了對芽胞桿菌Bacillussp. TSH1繼續(xù)進行改進以進一步提高其產(chǎn)量和得率，需要對該菌株丁醇代謝通路中關(guān)鍵酶的種類、活性及其變化有清晰的了解。酶是細胞內(nèi)生物化學反應的催化劑，其存在與否及活性的高低影響發(fā)酵產(chǎn)物的形成和產(chǎn)量[3]。丁醇發(fā)酵主要分為產(chǎn)酸期和產(chǎn)溶劑期，在溶劑生成的階段，丁醛脫氫酶是由丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丁醛的關(guān)鍵酶，為NADH依賴型。丁醇脫氫酶是由丁醛轉(zhuǎn)化為丁醇的關(guān)鍵酶，為NADPH依賴型。乙醇脫氫酶是由乙酰輔酶A生成乙醛再進而生成乙醇的關(guān)鍵酶[1]。在丙酮丁醇梭菌中，醛脫氫酶和醇脫氫酶并不是單一的酶，而是由多個同工酶組成，這些酶都具有醇脫氫酶活性，共同催化乙醇、丁醇的生成[4-7]?；蚪M方面的研究表明，共有6個基因編碼醇脫氫酶，這些編碼產(chǎn)物包括2個具有雙功能的醛、醇脫氫酶和4個單一功能的醇脫氫酶[8]。隨著分子生物學技術(shù)發(fā)展，從核酸水平和蛋白水平對單個基因及蛋白的研究更加便利。但是酶是細胞功能的最終執(zhí)行者，正是這些同工酶的共同作用，決定了乙醇、丁醇的合成速度和效率，而這是單個基因和蛋白表達難以闡釋的。因此，研究細胞的整體酶活性水平對于研究丁醇發(fā)酵的進程具有重要的意義。

Bacillussp. TSH1與丙酮丁醇梭菌有相同的發(fā)酵產(chǎn)物，推測由相似的酶進行催化，因此，本文借鑒丙酮丁醇梭菌的研究，對Bacillussp.TSH1丁醇發(fā)酵過程中丁醛、丁醇、乙醇合成的關(guān)鍵酶的活性進行了研究，分析了產(chǎn)丁醇和其他溶劑代謝途徑中乙醇脫氫酶，丁醛脫氫酶，丁醇脫氫酶這3種酶在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律，對進一步解析Bacillussp. TSH1丁醇和乙醇合成代謝途徑及調(diào)控機制奠定了基礎，也對該菌株在蛋白水平的表達分析提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種Bacillus. sp. TSH1為清華大學核能與新能源技術(shù)研究院新能源研究所保藏；玉米粉購自北京市昌平區(qū)虎峪村；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、考馬斯亮藍G250購自北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司；牛血清蛋白 (BSA)、二硫蘇糖醇(DTT)、NADH鈉鹽、NADPH鈉鹽、丁酰輔酶A均購自Sigma公司；鹽酸氨基脲購自國藥集團化學試劑有限公司；丁醛為化學純；葡萄糖、乙醛，鹽酸，磷酸等均為分析純。

1.2 設備

759S紫外分光光度計為上海菁華科技儀器有限公司生產(chǎn)；電熱恒溫培養(yǎng)箱為北京中興偉業(yè)儀器有限公司生產(chǎn)的DH-500AB (303-3AB)；5 L發(fā)酵罐為德國Sartorius的Biostat○RBpuls；氣相色譜和液相色譜分別為日本島津公司的GC 2010和LC 20AD；超聲波細胞粉碎機為寧波新芝生物科技股份有限公司的JY 92-Ⅱ；冷凍離心機為Sigma公司的2-16PK和Himac公司的CR22G。

1.3 培養(yǎng)基和緩沖液

P2半合成培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖 36.3，酵母浸粉1.0。

緩沖液配方 (g/L)：K2HPO450.0，KH2PO450.0，CH3COONH4220.0，過濾滅菌。

微量元素液配方 (g/L)：MgSO4·7H2O 20.0，MnSO4·H2O 1.0，NaCl 1.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.0，對氨基苯甲酸0.1，維生素B1 0.1，生物素0.001，過濾滅菌。

接種前以1%的比例將緩沖液和微量元素液加入P2半合成培養(yǎng)基中[9-11]。

1.4 方法

1.4.1 菌種培養(yǎng)

菌種活化培養(yǎng)：將1 mL凍存的菌種Bacillussp. TSH1在超凈臺中接入15 mL 5%的玉米培養(yǎng)基中，電熱恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。

搖瓶擴大培養(yǎng)：將充分活化的菌種以體積比7%的接種量接種于200 mL P2培養(yǎng)基中，電熱恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：將擴大培養(yǎng)后的菌種接入發(fā)酵罐中 (5 L發(fā)酵罐裝3 L P2半合成培養(yǎng)基)，接種量為7%，37 ℃靜置發(fā)酵，自然pH，從發(fā)酵9 h起，每隔3 h取一次樣至發(fā)酵結(jié)束。

1.4.2 樣品處理

將樣品4 ℃、10 000 r/min離心10 min，棄上清；5 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 7.5)清洗，上述條件離心后，重懸于1 mL緩沖液 (含1 mmol/L DTT)，于冰浴中進行細胞的循環(huán)破碎，超聲功率200 W，每次工作30 s，間隔10 s，6次循環(huán)。破碎后4 ℃、10 000 r/min離心15 min，上清液即為酶粗提液[12]。蛋白含量的測定采用Bradford 法[13]。

1.4.3 酶活檢測

乙醇脫氫酶的反應體系為 1 mL，含50 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 7.5)，1 mmol/L DTT，0.2 mmol/L NADH，5.1 mmol/L乙醛，測定波長為340 nm[14]。

丁醛脫氫酶的反應體系為 0.87 mL，含67 mmol/L Tris-HCl (pH 6.0)，1 mmol/L DTT，0.27 mmol/L NADH，72 mmol/L 鹽酸氨基脲，0.2 mmol/L丁酰輔酶A，測定波長為365 nm。

丁醇脫氫酶的反應體系為 0.86 mL，含77 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 7.8)，0.23 mmol/L NADPH，11 mmol/L丁醛，測定波長為365 nm[15]。

三種反應體系中均含有細胞提取物 (含0.5 mg蛋白質(zhì))。30 ℃，每30 s測定一次吸光度的變化，測12 min，測定均在空氣中進行。脫氫酶與底物的反應在2 mm光程的石英比色杯中進行，從加入底物開始，測定紫外分光光度計在相應波長下吸收值的變化[16-18]。依據(jù)NAD(P)H的摩爾消光系數(shù)計算酶的比活。

式中，ΔOD：吸收值每分鐘降低的平均值(min?1)；V：反應體系的體積 (L)；ε：摩爾消光系數(shù)；εNADH (365 nm)＝1760 L/(mol·cm)；εNADPH (365 nm)＝1 753 L/(mol·cm)；C：測定中所加入酶蛋白的量 (mg)；0.2：比色杯的光程(cm)；106：摩爾轉(zhuǎn)化為微摩爾的系數(shù)。

1.4.4 溶劑產(chǎn)量的測定

溶劑產(chǎn)量的測定以異丁醇為內(nèi)標物，發(fā)酵液12 000 r/min離心5 min，取上清液，按發(fā)酵液：異丁醇：H2O=1∶1∶2 (V/V/V) 混合后采用氣相色譜儀進樣檢測。色譜柱為 KB-5MS，25 m×0.53 mm×1.00 μm；檢測器 FID；進樣溫度 240 ℃；檢測溫度 260 ℃；柱溫 80 ℃ (保溫 5 min) ～120 ℃(保溫3 min)；載氣為N2，流速2.5 mL/min，進樣量1 μL。根據(jù)氣相色譜保留時間和峰面積信息對溶劑進行定性和定量。根據(jù)標準曲線和進樣量計算發(fā)酵液中溶劑含量[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bacillus sp. TSH1發(fā)酵結(jié)果

Bacillussp. TSH1是兼性厭氧的芽胞桿菌，可有氧生長、微氧發(fā)酵，這一發(fā)現(xiàn)不同于傳統(tǒng)的梭狀芽胞桿菌必須在嚴格厭氧條件下的丁醇發(fā)酵 (即傳統(tǒng)ABE發(fā)酵)。由于操作不需要專門的厭氧設備，使操作大大簡化，而且節(jié)約了設備成本。接種過程在超凈臺 (有氧環(huán)境) 進行，發(fā)酵過程在5 L的發(fā)酵罐中進行，恒溫37 ℃下，監(jiān)控不同發(fā)酵階段的pH值并間隔取樣，測定OD值以及底物和產(chǎn)物的濃度。菌體生長曲線，pH值與底物和產(chǎn)物的濃度變化如圖 1所示。在36.33 g/L的初糖濃度下，溶劑在12 h開始產(chǎn)生，同時伴隨pH的下降，進入產(chǎn)酸期。24 h后，溶劑產(chǎn)量迅速增加，進入產(chǎn)溶劑期。葡萄糖在33 h全部消耗，同時pH達到最低點，OD達到最大值。發(fā)酵在36 h終止，此時，菌種的OD值降低到最大值的一半，丁醇、丙酮和乙醇的比例約為7∶2∶1。丁醇的得率為 19.6%，終產(chǎn)量為7.13 g/L，占ABE總量的70%。該結(jié)果與Danie等對C. acetobutylicumATCC 824的研究結(jié)果相似[20]。

2.2 乙醇脫氫酶活性變化

乙醇脫氫酶是由乙酰輔酶 A生成乙醛再進而生成乙醇的關(guān)鍵酶。如圖2所示，發(fā)酵初期的9 h到12 h，菌體內(nèi)存在的乙醇脫氫酶活性迅速升高，并在12 h時達到最大值0.054 U/mg，乙醇產(chǎn)量沒有明顯增長。隨著發(fā)酵時間的進行，在12 h到 24 h，乙醇脫氫酶活性迅速下降到0.01 U/mg，相比最大值喪失了81%的活性。24 h后直到發(fā)酵結(jié)束時，菌體內(nèi)乙醇脫氫酶活性維持在 0.006～0.01 U/mg。這段時間內(nèi)盡管酶活性不高，但乙醇產(chǎn)量迅速增加，在發(fā)酵結(jié)束時，乙醇產(chǎn)量為1.09 g/L。

2.3 丁醛/醇脫氫酶活性變化

圖1 Bacillus sp. TSH1發(fā)酵結(jié)果 (A：丁醇、丙酮和乙醇的合成；B：細胞生長、葡萄糖消耗和pH的變化)Fig. 1 Fermentation results of Bacillus sp. TSH1. (A) Syntheses of butanol, acetone and ethanol. (B) Variations of OD600, pH and glucose concentration.

圖2 乙醇脫氫酶活性與乙醇產(chǎn)量的變化Fig. 2 Changes about specific activity of alcohol dehydrogenase and concentration of ethanol.

圖3 丁醛/丁醇脫氫酶和丁醇產(chǎn)量的關(guān)系Fig. 3 Relationships among specific activities of butanol dehydrogenase, butyraldehyde dehydrogenase and butanol concentration.

丁醛脫氫酶是由丁酰輔酶 A轉(zhuǎn)化為丁醛的關(guān)鍵酶，為 NADH依賴型。丁醇脫氫酶是由丁醛轉(zhuǎn)化為丁醇的關(guān)鍵酶，為NADPH依賴型。如圖3所示，在發(fā)酵的初始階段，兩種酶的酶活均隨發(fā)酵時間延長逐漸增大，丁醇脫氫酶活性的變化要明顯大于丁醛脫氫酶，在發(fā)酵進行到 15 h時，丁醛脫氫酶的活性基本沒有發(fā)生改變，但丁醇脫氫酶的活性已經(jīng)達到最大值0.055 U/mg，此時，丁醇產(chǎn)率也從發(fā)酵初期的緩慢增長變?yōu)檠杆偕仙?5 h后，丁醛脫氫酶的活性開始增加并在21 h達到最大值0.035 U/mg，此時丁醇脫氫酶的活性只有最大值的44%，21 h后，兩種酶的活性均逐漸迅速下降且在發(fā)酵結(jié)束時基本失活。這段時間內(nèi)，盡管丁醇的產(chǎn)量在增加，但是產(chǎn)率逐漸減慢，發(fā)酵終止時丁醇的產(chǎn)量為7.13 g/L。Peter Diirre等對C. acetobutylicumDSM 1732進行了研究，丁醛脫氫酶的活性在丁醇產(chǎn)量開始增加時達到最大值，而丁醛脫氫酶則在發(fā)酵完全進入產(chǎn)溶劑期后才達到最大值[12]。

3 討論

國內(nèi)外一些學者從不同的產(chǎn)丁醇菌株出發(fā)對其進行改造后，丁醇產(chǎn)量或得率等有所提高[21]，但均為嚴格厭氧菌，對設備要求嚴格。王風芹等從種植懷地黃的土壤中通過富集培養(yǎng)和分離純化等得到一株產(chǎn)丁醇的兼性厭氧菌Bacillussp.C2，以 7%玉米醪液為原料，丁醇產(chǎn)量可達11.2 g/L[22]。本實驗室自行分離得到的Bacillussp.TSH1以 5%玉米醪液為原料，丁醇產(chǎn)量可達11.39 g/L。不同的丁醇發(fā)酵菌株的特性對比如表1所示。

Qureshi等曾對C. beijerinckiiBA 101發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的經(jīng)濟性進行評估。當每噸玉米的價格為79.23美元時，在ABE生產(chǎn)能力為153 000 t的工廠中，生產(chǎn)設備成本和總成本分別為 33.47×106和110.46×106美元。當ABE得率為0.42 (gABE/g葡萄糖) 時，丁醇的價格預計為0.34美元/kg[27]。

篩選得到的TSH1菌株是兼性厭氧菌，對形態(tài)學、生理生化特性研究及16S rRNA測序，表明該菌株為芽胞桿菌。Bacillussp. TSH1與丙酮丁醇梭菌 ATCC824等嚴格厭氧菌的發(fā)酵過程和代謝產(chǎn)物類似，故推測溶劑產(chǎn)生也由類似的關(guān)鍵酶催化完成。從本研究結(jié)果可以看出，Bacillussp.TSH1具有乙醇脫氫酶、丁醛脫氫酶以及丁醇脫氫酶，可以實現(xiàn)由乙醛到乙醇，以及丁酰輔酶A到丁醛再到丁醇的轉(zhuǎn)化，從而證明了該菌株產(chǎn)溶劑代謝途徑的存在，在菌株Bacillussp. TSH1的發(fā)酵工藝已經(jīng)得到優(yōu)化且代謝通路已經(jīng)明確的情況下，分析這3種酶在發(fā)酵過程中的酶活變化規(guī)律，對進一步解析Bacillussp. TSH1丁醇和乙醇合成代謝途徑及調(diào)控機制奠定了基礎，也對Bacillussp. TSH1在蛋白水平的表達分析提供了參考。

表1 不同丁醇發(fā)酵菌株的對比Table 1 Comparisons of different butanol-forming strains

本文檢測乙醇脫氫酶所用輔酶為NADH，在乙醇剛開始生成時，比活即達到最高，相對9 h增加了2.6倍。丁醛脫氫酶所用輔酶也是NADH，在發(fā)酵進行到產(chǎn)溶劑期后比活達到最大值，相比9 h增加了 3.16倍，而丁醇脫氫酶輔酶則使用NADPH，在產(chǎn)酸期比活就已經(jīng)達到最大值，較其他兩種酶而言增加最少，相對9 h增加了1.82倍。其他研究者對不同菌種的丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶也做過檢測，分別使用不同的細胞破碎方法，離心條件以及不同的底物和輔酶進行反應[12]。具體結(jié)果比較如表2所示。

從Bacillussp. TSH1與其他菌株脫氫酶活的比較結(jié)果可以看出，在底物及輔酶類型相同時，Bacillussp. TSH1中丁醇脫氫酶及丁醛脫氫酶的最大酶活結(jié)果與其他菌株相似，與預期結(jié)果一致，即盡管菌株對氧的耐受性不同，相同的反應由相似的酶進行催化。

從Bacillussp. TSH1中脫氫酶的比活與溶劑產(chǎn)生的關(guān)系上看，3種酶在發(fā)酵開始即迅速升高，但是溶劑在緩慢生成。在酶活下降之后，溶劑的產(chǎn)量仍在增加，這是因為檢測的酶活性是瞬時的，而乙醇產(chǎn)量是累積的，因此即使在后期酶活較低的情況下，產(chǎn)物的濃度也在不斷升高。另外，本文所檢測的為酶的比活力，而從OD值可以看出 (圖1B)，在發(fā)酵開始至結(jié)束之前的33 h，OD值一直在持續(xù)升高，表明發(fā)酵液中細胞濃度在不斷增大，因而，發(fā)酵后期單位體積的蛋白濃度也較高，單位發(fā)酵液中總的酶活性可能保持恒定水平。所以，在發(fā)酵后期，總體的酶活水平仍可以維持溶劑產(chǎn)量的持續(xù)增長。

另外，由于丁醇對細胞的毒性，當發(fā)酵液中丁醇的質(zhì)量濃度增大到11 g/L時，細胞因受到丁醇的抑制而不能生長[33]，因此，高丁醇耐受性菌種的選育以及誘變菌株的丁醇代謝途徑中關(guān)鍵酶的測定也是該課題未來進行研究的重要

內(nèi)容[34-35]。

表2 不同文獻報道的丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶的比活及測定條件比較Table 2 Comparisons of specific activity and measurement conditions of butanol dehydrogenase and butyraldehyde dehydrogenase as reported in the literatures

[1]Jin XQ, Wang GL, He BF, et al. Research progress and high yield strategy of acetone-butanol fermentation. Chem Ind Eng Prog, 2007, 26(12):1727?1732 (in Chinese).

靳孝慶, 王桂蘭, 何冰芳, 等. 丙酮丁醇發(fā)酵的研究進展及其高產(chǎn)策略. 化工進展, 2007, 26(12):1727?1732.

[2]Liu Y, Liu HJ, Zhang JA, et al. Mutation ofCl.beijerinckiiprotoplasts by60Co-γ irradiation. J Chem Eng, 2009, 10(60): 2549?2554 (in Chinese).

劉婭, 劉宏娟, 張建安, 等.60Co-γ對Cl.beijerinckii原生質(zhì)體的輻照誘變. 化工學報,2009, 10(60): 2549-2554.

[3]Gao XF , Zhao H , Zhang GH, et al. Genome shuffling ofClostridium acetobutylicumCICC 8012 for improved production of acetone-butanol-ethanol (ABE). Curr Microbiol,2012, 65(2): 128?132.

[4]Walter KA, Bennett GN, Papoutsakis ET.Molecular characterization of twoClostridium acetobutylicumATCC 824 butanol dehydrogenase isozyme genes. J Bacteriol, 1992, 174(22):7149?7158.

[5]Petersen DJ, Welch RW, Rudolph FB, et al.Molecular cloning of an alcohol (butanol)dehydrogenase gene cluster fromClostridium acetobutylicumATCC 824. J Bacteriol, 1991,173(5): 1831?1834.

[6]Welch RW, Rudolph FB, Papoutsakis ET.Purification and characterization of the NADH-dependent butanol dehydrogenase fromClostridium acetobutylicum(ATCC 824). Arch Biochem Biophys, 1989, 273(2): 309?318.

[7]Fontaine L, Meynial SI, Girbal L, et al. Molecular characterization and transcriptional analysis of adhE2, the gene encoding the NADH-dependent aldehyde/alcohol dehydrogenase responsible for butanol production in alcohologenic cultures ofClostridium acetobutylicumATCC 824. J Bacteriol, 2002, 184(3): 821?830.

[8]N?lling J, Breton G, Omelchenko MV, et al.Genome sequence and comparative analysis of the solvent-producing bacteriumClostridium acetobutylicum. J Bacteriol, 2001, 183(16):4823?4838.

[9]Lee J, Blaschek HP. Glucose uptake inClostridium beijerinckiiNCIMB 8052 and the solvent-hyper producing mutant BA101. Appl Environ Microbiol,2001, 11: 5025–5031.

[10]Chen CK, Blaschek HP. Examination of physiological and molecular factors involved in enhanced solvent production byClostridium beijerinckiiBA101. Appl Environ Microbiol, 1999,5: 2269?2271.

[11]Thaddeus E, Qureshi N, Blaschek HP. Production of acetone-butanol-ethanol(ABE) in a continuous flow bioreactor using degermed corn andClostridium beijerinckii.Process Biochem, 2007,42(1): 34－39.

[12]Diirre P, Kuhn A, Gottwald M. Enzymatic investigations on butanol dehydrogenase and butyraldehyde dehydrogenase in extracts ofClostridium acetobutylicum.Appl Microbiol Biotechnol, 1987, 26: 268?272.

[13]Wang XP, Xing SL. Determination of protein quantitation using the method of coomassie brilliant blue. Tianjin Chem Ind, 2009, 23(3):40?41 (in Chinese).

王孝平, 邢樹禮. 考馬斯亮藍法測定蛋白含量的研究. 天津化工, 2009, 23(3): 40?41.

[14]Stephen FH, Zhu CX. Butanol-ethanol dehydrogenase and butanol-ethanol-isopropanol dehydrogenase: different alcohol dehydrogenases in two strains ofClostridium beijerinckii(Clostridium butylicum). Appl Environ Microbiol, 1987, 53(4):697?703.

[15]Diirre P, Kuhn A, Gottschalk G. Treatment with allyl alcohol selects specifically for mutants ofClostridium acetobutylicumdefective in butanol synthesis. FEMS Microbiol Lett, 1986, 36: 77?81.

[16]Yao WB. Introduction of Biotechnology Pharmaceutical. Beijing: China Medical Science Press, 2003, 125?127 (in Chinese).

姚文兵. 生物技術(shù)制藥概論. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2003, 125?127.

[17]Girbal L, Soucaille P. Regulation of solvent production inClostridium acetobutylicum. Trends Biotechnol, 1998, 16 (1): 11?16.

[18]Yan RT, Zhu CX, Golemboski C. Expressing solvent-forming enzymes and onset of solvent production in batch cultures ofClostridium beijerinkii(Clostridium butylicum). Appl Environ Microbiol, 1988, 54: 642?648.

[19]Parekh M, Formanek J, Blaschek HP. Development of a cost-effective glucose-corn steep medium for production of butanol byClostridium beijerinckii. J Ind Microbiol Biotechnol, 1998, 21: 187–191.

[20]Petersen DJ, Bennett GN. Enzymatic characterization of a nonmotile, nonsolventogenicClostridium acetobutylicumATCC 824 mutant.Curr microbiol, 1991, 23(11): 253?258.

[21]Annous BA, Blaschek HP. Isolation and characterization ofClostridium acetobutylicummutants with enhanced amylolytic activity. Appl Environ Microbiol, 1991, 57(9): 2544?2548.

[22]Wang FQ, Xie H, Chu LR, et al. Screening and identification of aBacillusstrain producing butanol. Microbiol China, 2010, 37(1): 7?11 (in Chinese).

王風芹, 謝慧, 楚樂然, 等. 產(chǎn)丁醇芽孢桿菌的分離，篩選與鑒定. 微生物學通報, 2010, 37(1):7?11.

[23]Lin YL, Blaschek HP. Butanol production by a butanol-tolerant strain ofClostridium acetobutylicumin extruded corn broth. Appl Environ Microbiol, 1983, 3(3): 966-973.

[24]Lee J, Jang YS, Choi SJ, et al. Metabolic engineering ofClostridium acetobutylicumATCC 824 for Isopropanol-Butanol-Ethanol fermentation.Appl Environ Microbiol, 2012, 78(5): 1416?1423.

[25]Gu Y, Hu SY, Chen J, et al. Ammonium acetate enhances solvent production byClostridiumacetobutylicumEA 2018 using cassava as a fermentation medium. J Ind Microbiol Biotechnol,2009(36): 1225–1232.

[26]Jiang Y, Xu C, Dong F, et al. Disruption of the acetoacetate decarboxylase gene in solvent-producingClostridium acetobutylicumincreases the butanol ratio. Metab Eng, 2009,11(4/5): 284-191.

[27]Qureshi N, Blaschek HP. ABE production from corn: a recent economic evaluation. J Ind Microbiol Biotechnol, 2001, 27: 292–297.

[28]Chen CK, Blaschek HP. Acetate enhances solvent production and prevents degeneration inClostridium beijerinckiiBA101. Appl Microbiol Biotechnol, 1999, 52(2): 170?173.

[29]Petitdemange H, Cherrier C, Bengone JM, et al.Study of the NADH and NADPH-ferredoxin oxidoreductase activities inClostridium acetobutylicum. Can J Microbiol, 1977, 23(2):152?160.

[30]Gerckens B. Studies on the growth and solvent production ofClostridium acetobutylicum[D].Germany: University of Gottingen, 1980.

[31]Andersch W, Bahl H, Gottschalk G. Level of enzymes involved in acetate, butyrate, acetone and butanol formation byClostridium acetobutylicum.Appl Microbiol Biotechnol, 1983, 18: 327?332.

[32]George HA, Chen JS. Acidic conditions are not obligatory for onset of butanol formation byClostridium beijerinckii(Synonym,C. butylicum).Appl Environ Microbiol, 1983, 46(2): 321?327.

[33]Linden JC, Moreira AR, Lenz TG. Comprehensive Biotechnology. Oxford: Pergamon Press, 1985.

[34]Zhou X, Traxler RW. Enhanced butanol production and reduced autolysin activity after chloramphenicol treatment ofClostridium acetobutylicumATCC 824. Appl Microbiol Biotechnol, 1992, 37(3): 293?297.

[35]Westhuizen A, Jones DT, Woods DR. Autolytic activity and butanol tolerance ofClostridium acetobutylicum. Appl Environ Microbiol, 1982, 44:1277?1281.

September 25, 2012; Accepted: March 11, 2013

Jian’an Zhang. Tel/Fax: +86-10-89796086; E-mail: zhangja@tsinghua.edu.cn

國家自然科學基金 (No. 21176141)，清華大學自主科研計劃 (No. 2012THZ02289) 資助。

Key enzymes in butanol fermentation by a facultative anaerobeBacillussp. TSH1

Xiaorui Duan1,2, Genyu Wang2, Hongjuan Liu2, Jianwei Xue1, and Jian’an Zhang2

1Institute of Fine Chemical,Taiyuan University of Technology,Taiyuan030024,Shanxi,China
2Institute of Nuclear and New Energy Technology,Tsinghua University,Beijing100084,China

Bacillussp. TSH1 is a butanol-producing microorganism newly isolated in our laboratory; it can grow and ferment under facultative anaerobic conditions, while sharing similar fermentation pathways and products withClostridium acetobutylicum.To illustrate the relationships between the products and the enzyme activities inBacillussp. TSH1, key butanol- and ethanol-forming enzymes were studied, including butyraldehyde dehydrogenase, butanol dehydrogenase and alcohol dehydrogenase. The activities of the three enzymes increased rapidly after the initiation of fermentation. Activities of three enzymes peaked before 21 h, and simultaneously, product concentrations also began to increase gradually. The maximum activity of alcohol dehydrogenase was 0.054 U/mg at 12 h, butyraldehyde dehydrogenase 0.035 U/mg at 21 h and butanol dehydrogenase 0.055 U/mg at 15 h. The enzyme activities then decreased, but remained constant at a low level after 24 h, while the concentrations of butanol, acetone, and ethanol continued increasing until the end of the fermentation. The results will attribute to the understanding of the butanol metabolic mechanism, and provide a reference for further study of a facultativeBacillusmetabolic pathway.

Bacillussp. TSH1, butanol fermentation, alcohol dehydrogenase, butanol dehydrogenase, butyraldehyde dehydrogenase

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21176141), Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (No.2012THZ02289).

(本文責編 郝麗芳)