PI-103對人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/DDP順鉑化療效果的影響

劉俊，蔡云朗，任慕蘭，吳迪 ，曾婭

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 江蘇南京 210009;2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210009)

卵巢癌是目前死亡率最高的婦科惡性腫瘤，化療是卵巢癌的重要治療措施之一。但相當(dāng)多患者因腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生藥物耐藥而導(dǎo)致化療失敗，因此，增強(qiáng)對化療藥物的敏感性是提高卵巢癌治療效果的有效途徑之一。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生化療耐藥的共同途徑是抑制凋亡，細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序的能力直接影響其化療藥物發(fā)揮作用的效應(yīng)。腫瘤細(xì)胞抑制進(jìn)入凋亡程序，進(jìn)而可以表現(xiàn)出對化療藥物的耐藥性，這也是腫瘤細(xì)胞的一種自我保護(hù)。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋 白 激 酶 B(serine/threonine kinase，Akt;protein kinase B，PKB)/哺乳動物雷帕霉素靶體蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程以及參與血管形成等多種功能，是最主要的抑制細(xì)胞凋亡的信號途徑［1-3］。本研究探討 PI3K/mTOR雙抑制劑 PI-103對人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株(SKOV3/DDP)細(xì)胞順鉑化療的影響以及可能機(jī)制，進(jìn)一步闡明該通路與卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的關(guān)系，為耐藥卵巢癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SKOV3/DDP(北京市腫瘤醫(yī)院藥物研究所)。一抗:Akt兔抗人多克隆抗體、Phospho-Akt(Ser473)抗體(Bioworld公司)，rps6鼠抗人單克隆抗體、Phosphorps6兔抗人單克隆抗體、Bax兔抗人單克隆抗體、Bcl-2兔抗人單克隆抗體(美國Cell signaling biotechnology公司)，β-actin兔抗人單克隆抗體(Sigma公司);二抗:HRP-標(biāo)記山羊抗鼠IgG、HRP-標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);PI-103(Cayman公司);順鉑(DDP，山東齊魯制藥廠);CCK-8試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品;胎牛血清(杭州四季青公司);RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3/DDP細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、相對濕度90%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長。

1.2.2 PI-103與SKOV3/DDP細(xì)胞共同培養(yǎng) 取對數(shù)生長期SKOV3/DDP細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×105ml－1接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，加入 PI-103 的終濃度為 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L－1，繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72 h，每個樣本設(shè) 3個復(fù)孔。

1.2.3 PI-103聯(lián)合DDP與SKOV3/DDP細(xì)胞共同培養(yǎng) 兩種藥物聯(lián)合作用時(shí)，DDP終濃度為0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 及 100.00 μmol·L－1，PI-103 濃度為 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L－1，每個樣本至少設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)孵育72 h。

1.2.4 CCK-8 法測定細(xì)胞抑制率 將 1.2.2、1.2.3處理過的96孔板，每孔加20 μl CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，在酶標(biāo)儀上測定波長為450 nm的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞抑制率［抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%］。根據(jù)各組DDP濃度和抑制率，計(jì)算兩者的回歸系數(shù)a、b，代入公式:Y=a+bln X，計(jì)算細(xì)胞順鉑IC50值。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 實(shí)驗(yàn)分組(1)聯(lián)合用藥組:取 PI-103 濃度為 1 μmol·L－1，DDP濃度為 12.5 μg·ml－1(接近于其 DDP IC50值);(2)DDP組:取 DDP 的濃度為 12.5 μg·ml－1;(3)PI-103 組:取 PI-103 的濃度為 1 μmol·l－1;(4)對照組:不加藥物處理。

按以上分組處理SKOV3/DDP細(xì)胞后均繼續(xù)培養(yǎng)24 h后消化、收集，制成含1×106ml－1的單細(xì)胞懸液1 ml，預(yù)冷的PBS沖洗3次，加入1 ml預(yù)冷的70%乙醇，4 ℃ 固定 24 h，離心，PBS沖洗，用含有10 μg·ml－1PI和 0.1%RNase A 的 PBS液染色，室溫避光30 min后用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 Western blot檢測 SKOV3/DDP 細(xì)胞 Akt、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)、rpS6、磷酸化的核糖體蛋白S6(p-rpS6)、Bcl-2、Bax及β-actin的表達(dá) 分別以PI-103、DDP及PI-103、DDP聯(lián)合作用于SKOV3/DDP細(xì)胞24 h后，每瓶細(xì)胞使用400 μl含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解緩沖液抽提細(xì)胞總蛋白。40 μg蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，用含0.05%Tween 20的TBS緩沖液(TBST)漂洗3次，每次10 min;加入相應(yīng)的堿磷酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，室溫1 h，ECL顯影、定影、曝光，結(jié)果采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。以β-actin作為上樣內(nèi)參，目的蛋白條帶灰度與內(nèi)參條帶灰度的比值作為各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。每個樣本至少重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

4月26日在奔赴阿斯特拉罕途中第三個點(diǎn)即是扎木揚(yáng)村，在扎木揚(yáng)渡口渡過伏爾加河，就可以來到建于19世紀(jì)的和碩特廟(Хошеутовский хурул)。

2 結(jié) 果

2.1 PI-103對SKOV3/DDP細(xì)胞生長的影響

見圖1。

圖1 PI-103對卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞生長抑制率的影響Fig 1 The effect of PI-103 on inhibition rate in SKOV3/DDP cell lines

PI-103能夠抑制SKOV3/DDP細(xì)胞的增殖，隨著PI-103 濃度的增加(0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L－1)，細(xì)胞生長抑制率逐漸增加(P ＜0.001)，而且隨著藥物作用時(shí)間(24、48、72 h)的延長，細(xì)胞的生長抑制作用也明顯增加(P＜0.001)。

2.2 不同濃度PI-103對SKOV3/DDP細(xì)胞順鉑化療的影響

見表1。

表1 PI-103與DDP聯(lián)用對SKOV3/DDP細(xì)胞生長的抑制率的影響(± s，n=3)Tab 1 The effect of PI-103 combined with DDP on inbibition rate in SKOV3/DDP cell lines± s，n=3)

表1 PI-103與DDP聯(lián)用對SKOV3/DDP細(xì)胞生長的抑制率的影響(± s，n=3)Tab 1 The effect of PI-103 combined with DDP on inbibition rate in SKOV3/DDP cell lines± s，n=3)

與對照組比較，a P ＜0.05

DDP/μg·mol－1 對照組PI-103 濃度/μmol·L－1 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 F 值 P值0.78 11.53 ±2.11 16.29 ±1.55a 20.46 ±0.06a 25.47 ±1.07a 30.66 ±0.41a 34.33 ±0.41a 136.082 ＜0.001 1.56 14.97 ±2.87 21.87 ±2.84 27.72 ±3.53a 24.36 ±1.03a 42.81 ±1.64a 44.78 ±3.61a 38.763 ＜0.001 3.13 23.49 ±5.19 25.32 ±3.84 36.05 ±2.09a 40.55 ±2.49a 49.12 ±6.32a 51.78 ±4.13a 22.876 ＜0.001 6.25 34.35 ±3.78 37.26 ±1.66 43.31 ±3.15 47.19 ±4.67a 56.94 ±5.58a 61.61 ±2.84a 23.742 ＜0.001 12.5 45.00 ±2.09 44.83 ±1.63 47.78 ±1.32 54.30 ±4.43a 59.39 ±2.26a 62.06 ±1.21a 28.752 ＜0.001 25 60.13 ±1.66 61.71 ±7.23 60.11 ±4.60 64.97 ±2.52 72.40 ±1.72a 75.07 ±1.30a 8.734 0.001 50 69.56 ±4.78 71.32 ±6.70 71.11 ±6.25 72.23 ±6.61 77.77 ±2.45 79.44 ±1.26 1.881 0.171 100 84.33 ±1.28 85.20 ±2.76 84.93 ±1.84 85.69 ±2.71 85.80 ±1.82 86.07 ±2.450.267 0.928

當(dāng) DDP 濃度為 0.78 μg·ml－1時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組SKOV3/DDP細(xì)胞抑制率與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.001)。當(dāng) DDP 濃度為 1.56 或 3.13 μg·ml－1，與濃度分別為 0.5、1.0、2.0、4.0 μmol的 PI-103共培養(yǎng)時(shí)，SKOV3/DDP細(xì)胞抑制率與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。當(dāng)DDP濃度為6.25或 12.5 μg·ml－1，與濃度分別 1.0、2.0、4.0 μmol·L－1的PI-103共培養(yǎng)時(shí)，SKOV3/DDP細(xì)胞抑制率與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。當(dāng)DDP 濃 度 為 25 μg· ml－1，與 濃 度 分 別 為 2.0、4.0 μmol·L－1的 PI-103 共培養(yǎng)時(shí)，SKOV3/DDP 細(xì)胞抑制率與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)?？梢钥闯?，PI-103聯(lián)合DDP給藥比單用順鉑對SKOV3/DDP細(xì)胞生長抑制作用更明顯。

以濃度分別為 0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L－1的PI-103作用于SKOV3/DDP細(xì)胞72 h，順鉑IC50值分別為(13.96 ±1.20)、(12.24 ±1.77)、(9.73 ±1.50)、(6.94 ±1.46)、(3.78 ±0.99)及(2.83 ±0.54)μg·ml－1。其中 PI-103 濃度為 0.25μmol·L－1時(shí)，順鉑IC50值與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他濃度PI-103作用下順鉑IC50值與對照組比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.865，P ＜0.001)。

實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，SKOV3/DDP細(xì)胞經(jīng)0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L－1的 PI-103 作用后對順鉑敏感性分別增加了 12.30%、30.28%、50.30%、72.96%、79.69%。

2.3 單藥及兩藥聯(lián)合對細(xì)胞凋亡率的影響

見圖2。

圖2 PI-103、DDP單藥及聯(lián)合用藥對SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡的影響(a P ＜0.001)Fig 2 The effect of PI-103 and DDP alone and in combination on the apoptosis of SKOV3/DDP cell lines(a P ＜0.001)

PI-103、DDP及兩藥聯(lián)合作用SKOV3/DDP細(xì)胞24 h后，F(xiàn)CM檢測其細(xì)胞凋亡的變化，PI-103聯(lián)合順鉑引起的細(xì)胞凋亡改變均明顯高于單獨(dú)用藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。

2.4 PI-103、DDP 對 SKOV3/DDP 細(xì)胞中 Akt、PAkt、rpS6及P-rpS6表達(dá)的影響

見圖3。

圖3 PI-103、DDP單藥及聯(lián)合用藥材SKOV3/DDP細(xì)胞Akt、p-Akt、rpS6、p-rpS6表達(dá)的影響Fig 3 The effect of PI-103 and DDP alone and in combination on the expression of Akt，p-Akt，rpS6，p-rpS6 in SKOV3/DDP cell lines

在SKOV3/DDP細(xì)胞中，使用PI-103能夠顯著降低細(xì)胞中p-AKT、p-rpS6蛋白的表達(dá)(P＜0.001);各組間Akt、rpS6蛋白表達(dá)兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);DDP組與對照組比較，各蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);聯(lián)合用藥組與PI-103比較，P-Akt蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，其余蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.5 PI-103、DDP對SKOV3/DDP細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax與Bcl-2表達(dá)的影響

見圖4。

在SKOV3/DDP細(xì)胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2在對照組細(xì)胞中表達(dá)量很高，促凋亡蛋白Bax表達(dá)量相對較低。以1 μmol·L－1的 PI-103 處理 SKOV3/DDP 細(xì)胞24 h，對Bcl-2和 Bax的表達(dá)幾乎沒有影響(P＞0.05);以 12.5 μg·ml－1的 DDP 作用于 SKOV3/DDP細(xì)胞24 h，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax達(dá)上調(diào);而PI-103與DDP聯(lián)合作用24 h，Bcl-2表達(dá)量進(jìn)一步下調(diào)，Bax表達(dá)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖4 PI-103、DDP單藥及聯(lián)合用藥對SKOV3/DDP細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的影響Fig 4 The effect of PI-103 and DDP alone and incombination on the expression of bcl-2，bax，in SKOV3/DDP cell lines

3 討 論

目前，鉑類化合物仍是卵巢癌化療的一線藥物，然而鉑類耐藥也是影響卵巢癌化療效果的主要原因。細(xì)胞凋亡是順鉑敏感性的決定性因素，PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是重要的抑制凋亡的途徑。相關(guān)文獻(xiàn)表明，該通路與卵巢癌［4］、大腸癌［5］等多種腫瘤的化療耐藥相關(guān)，一些研究［4-6］表明，腫瘤細(xì)胞中 Akt、mTOR的過表達(dá)或磷酸化水平上調(diào)與順鉑耐藥有關(guān)，而PI3K抑制劑或mTOR抑制劑能增加順鉑敏感性，其機(jī)制可能為:活化狀態(tài)的Akt直接使BAD磷酸化，從而使抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL活化抑制細(xì)胞凋亡;也抑制線粒體中細(xì)胞色素C的釋放，維持線粒體的完整性從而抑制細(xì)胞死亡;也能磷酸化FOXO轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程;還可抑制Bim的磷酸化，影響促凋亡系統(tǒng)的激活，且rp-S6蛋白的磷酸化參與調(diào)控促凋亡與抑凋亡系統(tǒng)的mRNA的翻譯如Mcl-1等［2］。Peng等［7］發(fā)現(xiàn)，Akt/mTOR通路的激活可以抑制DDP誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡作用，引起卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生DDP耐藥。將RAD001與DNA損傷誘導(dǎo)劑(如DDP)結(jié)合，可以通過調(diào)控mTOR通路增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對于DDP誘導(dǎo)凋亡的敏感性［8］。但也有研究［9］表明，單用 mTOR抑制劑可能反饋性上調(diào)了P-AKT(Ser473)，導(dǎo)致其作用減弱。Mazzoletti等將mTOR抑制劑和PI3K/mTOR雙抑制劑PI-103聯(lián)合應(yīng)用于人卵巢癌細(xì)胞與前列腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PI-103可以阻止由mTOR抑制劑反饋性激活PI3K/Akt途徑，更大程度地抑制AKT磷酸化，最終明顯減少癌細(xì)胞的生長、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移［10］。也有體外實(shí)驗(yàn)表明，PI-103還能提高紫杉醇、長春新堿、阿霉素等化療藥物抗腫瘤效果［11］。PI-103是一種能同時(shí)抑制P13K/mTOR的雙抑制劑，尤其作用于PI3Kα、mTORC1及mTORC2，也作用于70個其他激酶包括Ⅱ、Ⅲ類PI3Ks的多種代表性蛋白激酶，而且PI-103有良好的藥物穩(wěn)定性、毒副作用小。本研究通過應(yīng)用PI-103對卵巢癌耐藥株SKOV3/DDP的抗癌活性及其對順鉑化療作用的探究，進(jìn)一步闡述了PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與卵巢癌化療耐藥的關(guān)系，為改善卵巢癌化療耐藥提供理論依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，PI-103對卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞有明顯生長抑制作用，且具有濃度、時(shí)間依賴性，增加DDP對細(xì)胞生長的抑制作用，說明PI-103在卵巢癌中有抗癌活性，且能提高順鉑化療敏感性。本研究結(jié)果顯示，PI-103能明顯下調(diào)PI3K、mTOR的下游重要靶蛋白Akt、rp-S6的磷酸化水平，尤其是PI-103與DDP聯(lián)合作用時(shí)，能更大程度地抑制磷酸化Akt的表達(dá);而當(dāng) DDP 單獨(dú)作用時(shí)，Akt、p-Akt、rpS6、p-rpS6蛋白的表達(dá)幾乎無改變。同時(shí)，本研究也觀察到，PI-103單獨(dú)作用時(shí)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)幾乎無變化，而DDP單獨(dú)作用時(shí)能使Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax達(dá)上調(diào)，且聯(lián)合PI-103作用時(shí)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量進(jìn)一步上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量明顯下調(diào)，這說明PI-103可以增加順鉑對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控，促進(jìn)SKOV3/DDP細(xì)胞的凋亡，最終表現(xiàn)為促進(jìn)順鉑敏感性。PI-103明顯提高順鉑對SKOV3/DDP細(xì)胞生長的抑制作用，且能增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)，提示PI3K/Akt/mTOR信號通路傳導(dǎo)的阻滯可以提高卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。

綜上所述，PI3K/mTOR雙抑制劑PI-103能夠提高卵巢癌耐順鉑細(xì)胞株對順鉑的敏感性，且這種作用主要源于PI-103阻斷了PI3K/Akt/mTOR通路信號傳導(dǎo)，增加DDP對細(xì)胞生長的抑制作用，且加強(qiáng)順鉑對Bax與Bcl-2表達(dá)的調(diào)控及促凋亡作用，最終增強(qiáng)卵巢癌化療效果，為逆轉(zhuǎn)卵巢癌化療耐藥提供新的契機(jī)，因此，PI3K/mTOR雙抑制劑PI-103有望成為逆轉(zhuǎn)化療耐藥的靶向性藥物。

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