鈣調(diào)蛋白在門靜脈高壓內(nèi)臟高動力循環(huán)中的作用

陳駿毅，周全博，張岷，陳煒，羅蒙

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院普外科，上海 200127)

門靜脈高壓癥(portal hypertension，PHT)是由門靜脈壓力病理性升高所產(chǎn)生的綜合征，主要由肝硬化所引起。形成PHT的因素中，肝內(nèi)血管阻力增加是始動因素，而內(nèi)臟及全身高血流動力循環(huán)是阻力增加的結(jié)果，也是維持PHT的繼發(fā)因素。產(chǎn)生和維持高血流動力循環(huán)狀態(tài)的重要因素是持續(xù)的肝外血管擴張，而內(nèi)臟動脈血管的擴張作用尤為明顯［1-2］。在不同的PHT動物模型中都有內(nèi)臟血管擴張以及血流量增加的現(xiàn)象，從而引起門靜脈的血流量增加［3］。目前已知，PHT時內(nèi)臟血管擴張與血管擴張因子增多相關(guān)，其中一氧化氮(nitric oxide，NO)是最具代表性的血管擴張因子之一。動脈產(chǎn)生過多NO在PHT血管功能異常中具有重要作用。眾多研究已經(jīng)證實，PHT中過多產(chǎn)生的NO主要是由于內(nèi)皮型NO合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)活化增加所引起［4-5］。

鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)是一種穩(wěn)定的鈣結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白，它參與調(diào)控各種生命進程，包括代謝、炎癥反應(yīng)以及血管的收縮與舒張等，是第一個被證實的可以調(diào)節(jié)eNOS的蛋白。它能夠激活eNOS，從而促進NO的生物合成［6］。作為eNOS的調(diào)節(jié)蛋白，CaM是否參與了PHT內(nèi)臟血管的擴張反應(yīng)，國內(nèi)外相關(guān)報道較少。本研究通過觀察四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝硬化PHT大鼠門靜脈血流動力學(xué)指標及腸系膜動脈內(nèi)CaM的表達變化，并比較CaM特異性抑制劑W-7干預(yù)前后PHT大鼠腸系膜微動脈對去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)的反應(yīng)性，探討CaM在CCl4誘導(dǎo)肝硬化PHT內(nèi)臟高動力循環(huán)中的作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇雄性SD大鼠80只，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，體重(220±30)g。飼養(yǎng)條件:SPF級動物房，恒溫恒濕，光照和黑暗各12 h交替，自由飲水和進食顆粒飼料。隨機分為PHT組(n=60)和對照組(n=20)，60只SD大鼠制備PHT模型。

1.2 模型制備

將配制好的60%的CCl4油溶液(CCl4∶植物油=3∶2)以 0.05 ml·kg－1作背部皮下注射，共 14 周，每周2次，同時間斷飲用5%乙醇，制備PHT模型。對照組以同樣的方式和劑量予生理鹽水(NS)皮下注射，正常飲食飲水。

1.3 主要儀器、抗體及試劑

微血管灌流槽由美國紐約醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室友情贊助;超聲探測儀購自美國百盛公司MYLAB，探頭型號為LA523;解剖顯微鏡和光學(xué)顯微鏡均購自日本Olympus公司;兔抗鼠CaM抗體由美國AbCaM公司提供;p-eNOS抗體由美國Cell Signaling Technology(CST)公司提供;W-7由美國Sigma公司提供;MOPS緩沖液由上海利韜生物科技有限公司提供。

1.4 實驗方法

四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)肝硬化門靜脈壓力＞12 mmHg且肝臟有明顯結(jié)節(jié)的大鼠納入PHT組。PHT模型制備成功后將大鼠分成兩部分，一部分(8只)與對照組大鼠各項指標進行對比，剩余的PHT組大鼠再隨機分為(1)PHT+W-7組(n=26):W-7溶于 NS配成50 μmol·L－1的溶液，從第 12 周開始，于背部注射CCl4的同時按5 mg·kg－1體重腹腔注射，每周2次，連續(xù)注射2周;(2)PHT+NS組(n=26):同樣的劑量和方式用NS腹腔注射。

1.4.1 門靜脈流量的測定 測定前24 h大鼠禁食、不禁水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉成功后，備皮、固定，超聲探測儀測量門靜脈流量。

1.4.2 門靜脈壓力的測定 參照文獻［7］的方法操作，測定前24 h大鼠禁食、不禁水。第14周造模完成之后，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉成功后正中切口進腹，分離門靜脈主干，將連接穿刺針的導(dǎo)管內(nèi)充滿NS，將穿刺針插入門靜脈主干并固定，導(dǎo)管端與換能器連接，通過多功能檢測儀直接讀取門靜脈壓力值(將零點設(shè)在第一腰椎上方1 cm處，即門靜脈起始部水平)。

1.4.3 標本的獲取 切取大鼠的全部系膜及小腸，立即置入0～4℃、pH=7.4的MOPS緩沖液中。剪取一段近端小腸及系膜保留備用，其余部分在解剖顯微鏡下分離并抽取腸系膜上動脈及其主要分支，置于－80℃保存。

1.4.4 血管灌流系統(tǒng)的建立和腸系膜微動脈對NE反應(yīng)性的測定 參照文獻［8］的方法操作。在解剖顯微鏡下，顯微解剖器械銳性分離保留的腸系膜三級微動脈(直徑約100 ～150 μm，長約2 ～3 mm)，并迅速轉(zhuǎn)移到血管灌流槽。并將此微動脈的近端套在灌流槽入口的玻璃微管上，11-0結(jié)扎線固定，加20 mmHg壓力沖去管腔內(nèi)血液，另一端套在出口的玻璃微管上，同樣方式固定(分離、轉(zhuǎn)移和固定過程中務(wù)必不能損傷血管)。將血管灌流槽與蠕動泵連接，構(gòu)成循環(huán)流動的系統(tǒng)。通過水浴鍋的加溫作用使循環(huán)溫度控制在37℃。入口的玻璃微管與壓力控制器相連，管腔緩慢加壓，達到并維持在80 mmHg。顯微鏡攝像系統(tǒng)與顯示器連接，通過VMR v1.02(一種測量軟件)系統(tǒng)可直接測量血管內(nèi)徑。獲取三級微動脈并在此環(huán)境中穩(wěn)定30 min，按累積濃度法(10－8～10－5mol·L－1)向循環(huán)系統(tǒng)中加入NE，同時記錄不同NE濃度下的血管內(nèi)徑，內(nèi)經(jīng)改變量(μm)占最大血管內(nèi)徑(μm)的百分比即為收縮率。以血管收縮率為縱坐標，NE濃度的常用對數(shù)值為橫坐標，繪制NE的量-效曲線圖，對比不同分組量-效曲線間的差異以及當收縮率達到50%時NE的濃度(即EC50值)。

1.4.5 腸系膜動脈內(nèi)CaM和p-eNOS蛋白表達的測定 采用Western-bloting方法分別檢測各組腸系膜動脈內(nèi) CaM和 p-eNOS的蛋白表達，以 β-actin為內(nèi)參照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組門靜脈流量

門靜脈流量 PHT 組為(1.874 5 ±0.156 54)ml·min－1，明顯低于對照組［(2.631 7 ± 0.143 98)ml·min－1］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。PHT組大鼠注射 W-7 后，門靜脈流量為(1.915 9 ±0.141 43)ml·min－1;在注射 NS后門靜脈流量為(1.867 8±0.086 05)ml·min－1。分別與 PHT 組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05，圖1)。

圖1 各組大鼠門靜脈流量的變化Fig 1 Changes of portal vein blood flow in rats of each group

2.2 門靜脈壓力的變化

門靜脈壓力對照組為(7.43 ±0.66)mmHg，PHT組為(15.15±0.78)mmHg，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。PHT組注射 W-7后，門靜脈壓力為(14.95±1.24)mmHg;注射 NS 后，門靜脈壓力為(14.786 ±1.16)mmHg，分別與 PHT 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05，圖2)。

圖2 各組大鼠門靜脈壓力的變化Fig 2 Changes of portal vein pressure in rats of each group

2.3 腸系膜微動脈對NE的反應(yīng)性

與對照組相比，PHT組大鼠腸系膜微動脈的NE量-效曲線明顯右移，EC50也明顯增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。PHT組經(jīng)W-7處理后，NE量-效曲線明顯左移，EC50值也明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而經(jīng)NS處理前后，PHT大鼠的NE量-效曲線無明顯變化，EC50值也無明顯差異(圖3、4)。

圖3 各組大鼠腸系膜微動脈的NE量-效曲線圖Fig 3 The dose-response curves of mesenteric microcirculation artery to NE in rats of each group

2.4 各組腸系膜動脈內(nèi)CaM和p-eNOS蛋白表達的

Western-blot檢測結(jié)果顯示，PHT組腸系膜動脈內(nèi)CaM和p-eNOS的蛋白表達比對照組明顯上調(diào)，經(jīng)W-7干預(yù)之后，與PHT組相比，大鼠p-eNOS的蛋白表達明顯降低，但NS干預(yù)后大鼠p-eNOS的蛋白表達與PHT組無明顯變化(圖5)。

圖4 各組大鼠的EC50值，F(xiàn)ig 4 EC50values of rats in each group

圖5 各組大鼠腸系膜動脈內(nèi)CaM和p-eNOS的蛋白電泳條帶圖Fig 5 Protein electrophoretic bands of CaM and p-eNOS in mesenteric artery in rats of each group

3 討 論

本實驗通過對比正常大鼠與CCl4誘導(dǎo)的肝硬化PHT大鼠的門靜脈血流情況及肝內(nèi)阻力情況，證實了肝硬化PHT大鼠確實存在門靜脈血流量減少及肝內(nèi)阻力增加的現(xiàn)象;通過測定大鼠離體腸系膜微動脈對NE的反應(yīng)性變化還證實了肝硬化PHT內(nèi)臟動脈血管對縮血管物質(zhì)反應(yīng)性降低。這些實驗結(jié)果都與之前對門靜脈結(jié)扎所致的門靜脈高壓大鼠的研究結(jié)論相一致［9］。

國內(nèi)、外報道的其他的PHT動物模型中檢測到的CaM和p-eNOS表達是升高的［10-11］。我們對CCl4誘導(dǎo)的肝硬化PHT大鼠進行檢測，也得了相同的結(jié)論。PHT組經(jīng)CaM特異性抑制劑W-7處理后，大鼠內(nèi)臟動脈內(nèi)p-eNOS表達明顯降低。我們還發(fā)現(xiàn)，W-7可以增加肝硬化PHT大鼠腸系膜微血管對NE的反應(yīng)性，這些均說明過表達的CaM可能通過促進eNOS活化為p-eNOS，引起NO合成增加，參與PHT大鼠內(nèi)臟動脈低反應(yīng)性的形成。W-7通過抑制eNOS的活化來增強腸系膜微動脈對NE的反應(yīng)性，但又未能將其完全逆轉(zhuǎn)，說明還有其他的因素參與了PHT內(nèi)臟血管變化和高動力循環(huán)的形成，這些結(jié)果都與Gadano等［11］研究相一致。PHT組大鼠的門靜脈壓力較對照組明顯升高，說明CCl4誘導(dǎo)肝硬化PHT存在肝內(nèi)阻力增加，進而引起門靜脈流量的減少。但是W-7既不能改善門靜脈血流，也不能降低門靜脈壓力。我們認為門靜脈血流動力學(xué)的變化及門靜脈壓力的調(diào)節(jié)都是受多因素調(diào)控的，僅僅通過W-7來阻斷CaM信號通路可能并不足以影響門靜脈血流及門靜脈壓力，而且眾所周知，肝硬化PHT時肝內(nèi)、肝外的許多現(xiàn)象是矛盾的，PHT肝外血管擴張的同時，肝內(nèi)血管卻是收縮的，CaM信號通路的阻斷可能會增加肝內(nèi)血管的阻力，從而抵消改善肝外血管功能所帶來的益處［12］。

綜上所述，本實驗通過比較正常組大鼠和肝硬化PHT大鼠的內(nèi)臟動脈內(nèi)的CaM和p-eNOS的表達變化、腸系膜微動脈對NE的反應(yīng)性變化，以及W-7能抑制eNOS的活化并改善肝硬化PHT大鼠內(nèi)臟動脈對縮血管物質(zhì)低反應(yīng)性，證實了肝硬化PHT中過度生成的CaM通過增強eNOS的活化，增加NO的合成，降低內(nèi)臟動脈對縮血管物質(zhì)的反應(yīng)性，進而引起內(nèi)臟動脈擴張，參與高動力循環(huán)的形成，為臨床肝硬化PHT相關(guān)并發(fā)癥的治療提供了新的思路。

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