朝鮮蒲公英生殖類型確定

張 建 吳志剛 趙 鑫 馬 銘 寧 偉 *

（1沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2農(nóng)業(yè)部東北野菜種質(zhì)異位保存 圃 與鑒定中心，遼寧沈陽 110866）

我國有蒲公英屬植物70種，1變種，其中東北地區(qū)分布蒲公英11種。蒲公英已被我國《藥典》（2010年版）和《獸藥典》（2010年版）收錄為大宗藥材，同時被國家衛(wèi)生部列為藥食同源食品，廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)中藥以及飼料添加劑原料（張波 等，2011）。目前國內(nèi)外對蒲公英的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理活性、組織培養(yǎng)、加工技術(shù)等方面（陳華和李銀心，2004）。蒲公英屬植物存在無融合生殖、有性生殖和兼性生殖等生殖方式（黃群策，2000；胡適宜，2005），這是研究生殖類型非常寶貴的資源，但目前對其生殖特性未進行研究報道與詳細闡述。Whitton等（2008）通過授粉套袋試驗對歐洲蒲公英屬植物繁育系統(tǒng)進行研究，初步得出二倍體蒲公英為有性生殖，多數(shù)三倍體蒲公英為專性無融合生殖，少數(shù)三倍體以及四倍體蒲公英為兼性無融合生殖的結(jié)論，但并未對無融合的生殖類型以及胚和胚乳倍性之比做進一步分析。本試驗以東北地區(qū)廣泛分布的朝鮮蒲公英為試材，通過染色體計數(shù)、人工授粉試驗以及流式細胞儀檢測等試驗方法，確定其生殖類型，同時為蒲公英生殖遺傳規(guī)律以及分子機制研究奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試材于2008年5～8月采于遼寧東部山區(qū)，經(jīng)中國科學(xué)院沈陽生態(tài)研究所李冀云研究員鑒定為朝鮮蒲公英，栽種于東北野菜種質(zhì)資源異位保存圃生態(tài)試驗區(qū)，常規(guī)生態(tài)模式管理。2012年5月植株進入花期時進行各種觀察測定。

1.2 套袋、去雄及人工授粉試驗

2012年5月，朝鮮蒲公英處于盛花期，選擇生長勢良好的20株植株，每植株隨機選取未開放的3朵花，將60朵花分成6組（每組10朵），以自然條件下朝鮮蒲公英花序為對照，分別設(shè)5個處理：①不去雄套袋；②去雄套袋；③人工自交授粉套袋；④人工異交授粉套袋；⑤去雄去柱頭。為防止花葶倒伏，用木棍對花葶進行固定，待種子成熟后，統(tǒng)計結(jié)籽率。

1.3 染色體數(shù)目觀察

采用常規(guī)壓片法進行根尖染色體觀察（寧偉 等，2012）。

1.4 流式細胞儀檢測

以整個果序成熟種子（100粒左右）為材料，取植株2 g嫩葉為對照，在Chopping Buffer緩沖液（1.5 mL）中剪碎，經(jīng)300目篩網(wǎng)過濾，1 000 r·min-1離心10 min，棄上清，余下DNA加PI染色（一個樣加1 mL），搖勻，避光15 min，然后經(jīng)500目篩網(wǎng)過濾，搖勻，上機檢測。每次測定20 000個細胞。檢測結(jié)束后在流式細胞儀上得到各峰值相對倍性。

2 結(jié)果與分析

2.1 套袋、去雄及人工授粉試驗

由表1可見，自然條件下的結(jié)籽率為97.66%，除了人工異交授粉+套袋處理的結(jié)籽率較高，為86.56%外，其他處理結(jié)籽率均在50%左右。表明朝鮮蒲公英具有兼性無融合生殖現(xiàn)象，其無融合生殖發(fā)生率大約在50%左右，其生殖方式屬于無融合+專性異交類型。

2.2 染色體計數(shù)觀察

通過根尖細胞染色體觀察，確定朝鮮蒲公英染色體數(shù)目為32（圖1）。蒲公英屬植物染色體組基數(shù)為8，所以朝鮮蒲公英為四倍體。

表1 蒲公英不同授粉處理下的結(jié)籽率

2.3 朝鮮蒲公英后代檢測

胚囊類型、胚乳發(fā)育受精與否對胚乳細胞倍性水平影響較大（Urbani et al.，2002）。朝鮮蒲公英種子檢測出3個峰（圖2）。第一個峰值400，第二個峰值為590，第三個峰值為770，三者相比為1∶1.475∶1.925，3種倍性水平之比接近2C∶3C∶4C。二倍體峰反映的是胚的倍性情況，三倍體峰和四倍體峰表示胚乳細胞具有不同倍性水平。說明種子的胚和胚乳形成存在有性生殖情況，因此種子細胞中檢測到3種倍性峰。結(jié)果表明朝鮮蒲公英屬于兼性無融合生殖，且胚乳為自主發(fā)育。

圖1 朝鮮蒲公英根尖染色體數(shù)目

圖2 朝鮮蒲公英葉片以及種子DNA含量分布

3 結(jié)論與討論

朝鮮蒲公英去雄套袋結(jié)籽率為48.79%，表明其具有無融合生殖現(xiàn)象。植物無融合生殖特性與其倍性有特殊關(guān)系（劉傳虎 等，2007）。本試驗染色體觀察表明朝鮮蒲公英為四倍體，與少數(shù)三倍體以及四倍體蒲公英為兼性無融合生殖的結(jié)論一致（Whitton et al.，2008），流式細胞儀檢測結(jié)果表明朝鮮蒲公英為兼性無融合生殖類型，這與兼性無融合生殖植物山柳菊種子檢測結(jié)果一致（Matzk et al.，2000）。 本試驗為蒲公英無融合生殖胚乳自主發(fā)育提供了直接證據(jù)。

兼性無融合，就是有兩套生殖系統(tǒng)，除了真正的無融合后代，還有非母本的后代（Crane，2001）。這種兼性無融合生殖方式對于入侵新的生境條件是非常有益的（Wilson et al.，2006）。在兼性無融合中，有性和無融合胚囊發(fā)育時間是不同的，授粉時間對于決定有性/無融合的比例具有重要作用（Bicknell & Koltunow，2004；Krahulcová et al.，2004）。環(huán)境以及花粉量對無融合的發(fā)生率可能也有一定影響，這還需要進一步的試驗進行論證。

陳華，李銀心．2004．蒲公英研究進展和用生物技術(shù)培育耐鹽蒲公英展望．植物學(xué)通報，21（1）：19-25.

胡適宜．2005．被子植物生殖生物學(xué)．北京：高等教育出版社：232-247.

黃群策．2000．被子植物的無融合生殖．福州：福建科學(xué)技術(shù)出版社：76-78.

劉傳虎，張秋平，姚家玲，陳春麗．2007．龍須草核型分析和花粉母細胞減數(shù)分裂的細胞學(xué)研究．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，40（1）：27-33.

寧偉，吳杰，趙婷，趙鑫，李天來. 2012. 東北地區(qū)七種蒲公英核型研究．中國中藥雜志，37（6）：771-776.

張波，吳志剛，劉文毅，董文軒，趙鑫，寧偉．2011．蒲公英無融合生殖特性初探．沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，42（4）：475-478.

Bic knell R A，Koltunow A M．2004．Understanding apomixis：recent advances and remaining conundrums．Pla Cell，16：228-245.

Crane C F．2001．Classification of apomictic mechanisms//Savidan Y，Carman J G，Dresselhaus T．The flowering of apomixis：from mechanisms to genetic engineering．Mexico，D F：CIMMIT，IRD，European Commission D G VI （FAIR）：24-31．

Krahulcová A，Papou?ková S，Krahulec F．2004．Reproduction mode in the allopolyploid facultatively apomictic hawkweedHieracium rubrum（Asteraceae，H.subgen.Pilosella）．Hereditas，141：19-30.

Matzk F，Meister A，Schubert I．2000．An efficient screen for reproductive pathways using mature seeds of monocots and dicots．Plant Journal，21：97-108.

Urbani M H，Quarin C L，Espinoza F，Penteado M I O，Rodrigues I F．2002．Cytogeography and reproduction of the Paspalum simplex polyploidy complex．Plant Systematics and Evolution，236：99-105.

Whitton J，Sears C J，Baack E J，Otto S P．2008．The dynamic nature of apomixis in the angiosperms. Int J Pl Sci，169：169-182.

Wilson L M，F(xiàn)ehrer J，Br?utigam S，Grosskopf G．2006．A new invasive hawkweed，Hieracium glomeratum（Lactuceae，Asteraceae），in the Pacific Northwest．Canad J Bot，84：133-142.