西瓜遺傳圖譜的構(gòu)建及果形指數(shù)QTL分析

王兆吉 高 鵬 欒非時 劉 識

（東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，黑龍江哈爾濱 150030）

果實形狀是以鮮果為食用器官的園藝作物產(chǎn)品的市場品質(zhì)評價、分類及定級的重要考核指標，近年來國內(nèi)外專家學者對于果實形狀QTL定位研究取得了一定的進展。van der Knaap等（2002）分別定位了番茄第2、3條和11條染色體上的果形指數(shù)QTL-lifs2，lifs3，lifs11，其中l(wèi)ifs2和lifs11分別是調(diào)控果形ovate基因和sun基因的等位基因，這些QTL控制番茄梨形果形。van der Knaap等（2004）通過兩個雜交組合試驗及精細基因作圖，發(fā)現(xiàn)在番茄第7條染色體的短臂上有一個sun基因，控制果實形狀。Ben-Chaim等（2001，2006）和Zygier等（2005）的研究表明，辣椒果實大小、直徑、長度和果形指數(shù)間的QTL簇緊密連鎖，并且控制果實性狀的許多QTL都在同一條染色體上聚集。目前，對于西瓜果實形狀的遺傳分析和基因定位未見相關報道。在西瓜遺傳圖譜的構(gòu)建方面，Shimamoto和Harushima（1996）利用非洲野生類型西瓜SA-1與自交系H-7雜交所獲得的F2群體為試驗材料構(gòu)建了世界上的第一張西瓜遺傳連鎖圖譜，覆蓋基因組長度為524 cM，圖譜中包含有69個RAPD標記、1個同工酶標記、1個RFLP標記和3個形態(tài)標記。易克（2002）采用西瓜自交系97103與野生西瓜PI296341為親本材料構(gòu)建的重組自交系群體為試驗材料，獲得了一張覆蓋基因組總長度為1 383.8 cM，平均圖距為6.8 cM，分屬于19個連鎖群的遺傳連鎖圖譜，包含86個RAPD標記、24個SSR標記、10個ISSR標記、3個SCAR標記和79個AFLP標記以及1個形態(tài)學標記。Hawkings等（2001）利用抗枯萎病西瓜品系NHM與感枯萎病西瓜品系PI296341雜交所獲得的F2、F3群體為試驗材料，構(gòu)建出兩張覆蓋基因組長度分別為112.9 cM和132.0 cM的遺傳連鎖圖譜。

本試驗利用圓球形西瓜〔Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. et Nakai〕品系花園母本為母本，橢圓形西瓜品系LSW-177為父本，配制雜交組合獲得F2群體，利用SSR分子標記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，并進行果形指數(shù)的QTL分析，以期為今后進一步開展相關基因克隆及應用分子標記輔助育種奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗的母本材料是由東北農(nóng)業(yè)大學西甜瓜分子育種研究室提供的圓球形西瓜品系花園母本（原產(chǎn)地為中國），試驗的父本材料是由美國農(nóng)業(yè)部南部農(nóng)業(yè)研究中心Davis等（2008）提供的橢圓形低糖西瓜品系LSW-177 （原產(chǎn)地為美國）。利用常規(guī)方法配制雜交組合獲得F1，F(xiàn)1自交獲得由180個單株組成的F2群體。

1.2 試驗時間與地點

田間試驗于2010年3月至2012年8月在東北農(nóng)業(yè)大學香坊實驗實習基地進行，2010年3月將兩親本種植于實驗實習基地的24號溫室內(nèi)，雜交獲得F1種子，8月播種F1，嚴格自交授粉獲得單株F2種子。2011年5月定植兩親本、F1及F2群體于實驗實習基地的24號大棚內(nèi)，其中F2群體采用嚴格自交授粉及常規(guī)田間管理，自花授粉后35 d收獲，采收兩親本和F1果實各30株，F(xiàn)2果實180株，分別測定西瓜果實縱徑、橫徑。2011年2～9月在東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院西甜瓜分子研究室內(nèi)進行SSR引物的多態(tài)性篩選，兩親本及F2群體的DNA的提取，SSR-PCR擴增電泳檢測及譜帶分析。

1.3 田間試驗設計

分別種植兩親本和F1各30株，每小區(qū)種植10株，行距80 cm，株距50 cm，小區(qū)面積12 m2，3次重復；隨機種植F2群體180株，行距80 cm，株距50 cm，小區(qū)面積為90 m2。采用吊蔓栽培，雙蔓整枝。

1.4 性狀測量方法

果實縱徑：用直尺測量成熟西瓜果實的基部邊緣到頂部邊緣的最大距離。果實橫徑：用直尺測量成熟西瓜果實縱切面與果實縱軸垂直方向兩邊緣之間最大距離。西瓜果實縱徑與果實橫徑的比值即為果形指數(shù)。

1.5 分子試驗設計

2011年春季，在苗期采集母本、父本、F1、F2單株幼嫩真葉2 g，采用改良CTAB法提取西瓜基因組DNA（Luan et al.，2008）。甜瓜SSR引物序列來源于公開發(fā)表文獻（Danin-Poleg et al.，2001；Fazio et al.，2002；Silberstein et al.，2003；Gonzalo et al.，2005；Zalapa et al.，2007；Fernandez-Silva et al.，2008）和互聯(lián)網(wǎng)（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/dbEST；http：//www.icugi.org/）中葫蘆科作物EST信息庫和中國農(nóng)業(yè)科學院。西瓜SSR引物來源于公開發(fā)表文獻（易克 等，2003；Joobeur et al.，2006；Zhang Haiying et al. ，2012），總計 1 574對。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，西瓜SSR-PCR反應體系參考盛云燕等（2006）和張法惺等（2010）的方法，略有改動。擴增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，記錄帶型并分析，對分子試驗數(shù)據(jù)進行卡方檢驗，選擇符合1∶2∶1的分子標記，利用Mapmaker/Exp 3.0軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，利用MapChart2.1軟件繪制連鎖遺傳圖譜。

使用Microsoft?Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)記錄和整理，利用DPS軟件分析得到頻次分布圖；利用Windows QTL Cartographer V2.5軟件進行QTL分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取和SSR引物篩選

提取兩個親本、F1及F2群體180個單株的DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測，濃度和質(zhì)量均適用于SSR分子標記。選用1 574對SSR引物對兩親本進行擴增篩選，其中西瓜SSR引物355對（g-SSR引物194對，EST-SSR引物161對），甜瓜SSR引物1 219對（g-SSR引物848對，EST-SSR引物371對），共篩選出與親本有多態(tài)性并能穩(wěn)定遺傳的SSR引物55對，其中包括西瓜SSR引物36對（g-SSR引物32對，EST-SSR引物4對），多態(tài)率為10.14%，甜瓜SSR引物19對（g-SSR引物13對，EST-SSR引物6對），多態(tài)率為1.56%。

2.2 遺傳分析

由表1可知，母本及父本的果形指數(shù)平均值分別為1.04、1.51，分別屬于圓球形果實和橢圓形果實，可用于QTL分析。F1果形指數(shù)平均值為1.06，介于兩親本之間，與母本數(shù)值接近。F2群體果形指數(shù)大多數(shù)介于雙親之間，果形指數(shù)平均值為1.18，單株果形指數(shù)最高值為1.63，高于雙親，呈現(xiàn)正向超親優(yōu)勢，最低值為0.92，低于雙親，呈現(xiàn)負向超親優(yōu)勢。F2群體果形指數(shù)分離明顯，呈現(xiàn)單峰連續(xù)分布，峰度及偏度均小于1，由此可以證明其典型的數(shù)量性狀特征。對F2群體的果形指數(shù)進行分析，運用DPSV7.05軟件繪制頻次分布圖，如圖1所示。

表1 兩親本及F1、F2群體果形指數(shù)變化

圖1 果形指數(shù)在F2群體中的分布

2.3 西瓜遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

按照理論比值1∶2∶1計算F2群體的卡方值，55個標記中有45個標記符合1∶2∶1的理論比值，其中有10個表現(xiàn)出不同程度的偏分離，占總數(shù)的18.18%。

運用MAPMAKER/EXP 3.0軟件對其中45個標記進行連鎖分析，獲得了1張包含45個SSR標記，13個連鎖群的遺傳連鎖圖譜（圖2），圖譜總長度547.3 cM，標記間平均距離為12.44 cM，最大的連鎖群為第四連鎖群，分布9個標記，標記間平均距離為9.85 cM。最長的為第九連鎖群，長度為101.10 cM，第八連鎖群最短，長度為13.0 cM。

2.4 果形指數(shù)的QTL分析

利用花園母本×LSW-177獲得的F2群體構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜，結(jié)合果形指數(shù)的田間數(shù)據(jù)，采用Windows QTL Cartographer V2.5軟件進行QTL分析。結(jié)果表明（圖2），在第三連鎖群上發(fā)現(xiàn)了一個與果形指數(shù)緊密相關的QTL位點，為加性效應位點。以性狀英文縮寫、連鎖群編號和QTL編號為依據(jù)命名，將與果形指數(shù)密切相關的1個QTL位點命名為Fsi3.1，該位點位于第三連鎖群（圖2），圖譜位置45.8，在標記MCPI-12和CMN05_69之間，距離MCPI-12和CMN05_69兩標記的遺傳距離分別為2.4 cM和1.1 cM，LOD值3.1，貢獻率為2.8%，加性效應負值（-0.179 1），對減小果形指數(shù)表現(xiàn)為增效加性效應。

圖2 西瓜遺傳連鎖圖譜及果形指數(shù)相關QTL分析

3 結(jié)論與討論

在園藝作物果形指數(shù)的遺傳分析中，馬瑞娟等（2007）以油桃品種霞光和油蟠桃品系NF雜交組合為試材，證實F1果形指數(shù)分離比例符合1對等位基因的分離規(guī)律，蟠桃（扁盤形）對圓桃是完全顯性；李慧峰等（2010）在晚白塔桃自交試驗中也證實果實形狀為質(zhì)量性狀遺傳。但質(zhì)量遺傳分析是建立在果形指數(shù)為質(zhì)量性狀，性狀穩(wěn)定，且不考慮環(huán)境條件影響的基礎上，采用人為果形指數(shù)判斷及強行人為分級，這樣造成的人為誤差較大，遺傳分析結(jié)果應用有很大的局限性。更多的研究表明，果形指數(shù)是數(shù)量遺傳性狀，受微效多基因控制。陳克玲等（1994）對柑橘果形指數(shù)遺傳的研究認為，柑橘F1果形指數(shù)呈連續(xù)性變異，F(xiàn)1果形指數(shù)與親中值及母本果形指數(shù)均呈極顯著正相關，果形指數(shù)呈趨中或趨扁變異，果形指數(shù)為多基因控制的數(shù)量性狀。劉艷等（2001）在香梨果形指數(shù)遺傳研究上，劉志等（2004）在蘋果果形指數(shù)遺傳研究上得到了相似的結(jié)果。本試驗利用圓球形西瓜品系花園母本為母本，以橢圓形西瓜品系LSW-177為父本對西瓜果形指數(shù)的研究表明，親本果形指數(shù)在其雜種后代中占有較高的百分率，后代果形指數(shù)性狀呈多基因控制的數(shù)量性狀遺傳特征，進一步證實果形指數(shù)屬微效多基因控制的數(shù)量遺傳性狀。

本試驗找到了一個與果形指數(shù)相關的QTL位點，貢獻率較小，為2.8%，原因可能是西瓜的遺傳背景狹窄，不同西瓜種質(zhì)資源間遺傳多樣性較低，導致能夠用于SSR分子標記的引物數(shù)量相對較少。其次，本試驗中只采用了單一的SSR分子標記方法，結(jié)合田間數(shù)據(jù)和分子數(shù)據(jù)進行分析，在控制西瓜果形指數(shù)方面，還可能存在著貢獻率較大的QTL位點，還有待于通過開發(fā)更多的SSR標記引物及開發(fā)新的分子標記等方法獲得與西瓜果形指數(shù)密切相關的分子標記。

本試驗在SSR分子標記過程中出現(xiàn)了偏分離，標記的偏分離現(xiàn)象在植物的遺傳作圖中是一種普遍現(xiàn)象，并被認為是一種進化動力，自交不親和性和遺傳搭車效應（hitchhiking）（即分子標記偏分離程度與影響等位基因頻率的遺傳因子連鎖有關。在一些連鎖群中存在著控制配子生活力和競爭力的座位，其結(jié)果是導致配子選擇從而產(chǎn)生偏分離）是造成偏分離現(xiàn)象的兩種觀點。Oliver等（2001）利用甜瓜F2群體，采用RAPD、AFLP等標記，偏分離比率為5.8%；高美玲等（2011）利用甜瓜RIL6群體，采用SSR標記，偏分離比率為11.1%；易克等（2003）利用西瓜RIL8群體，采用SSR分子標記，偏分離比率為10%；劉莉等（2010）利用西瓜的F2群體，采用AFLP標記，偏分離比率為27%；本試驗利用西瓜的F2群體，采用SSR分子標記，偏分離比率為18.18%，由此可推斷，不同作圖群體，不同材料間存在很大不規(guī)律差異，本試驗偏分離比率較高，這可能是因為用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的F2群體數(shù)量有限，導致標記的分離呈現(xiàn)出一定的偏分離現(xiàn)象，或是檢測的標記與在一些連鎖群中存在著控制配子生活力和競爭力的座位連鎖緊密有關，總之要更進一步地闡明其機理，還要在偏分離基因座位的近等基因系（near-isogeniclines，NIL）發(fā)展方向進行更具體細致的研究。

本試驗采用圓球形品系花園母本和橢圓形品系LSW-177雜交獲得的F2群體為試驗材料，構(gòu)建了一張包含45個SSR標記，13個連鎖群的遺傳連鎖圖譜，覆蓋基因組長度為547.3 cM，標記間平均距離為12.44 cM。在遺傳圖譜的構(gòu)建過程中，采用了Zhang Haiying等（2012）在構(gòu)建西瓜核酸指紋圖譜中所使用的23對核心引物，這23對核心引物在供試的兩親本間共篩選出多態(tài)性引物16對，最終將其中的12對引物標記在本試驗所構(gòu)建圖譜的10個連鎖群上，這12對引物在連鎖群中的分布與西瓜核酸指紋圖譜中的分布相一致。

本試驗找到了與果形指數(shù)相關的QTL位點一個，為負向加性效應，由于F2群體為臨時作圖群體，找到的這個QTL位點有待于進一步利用重組自交系等永久作圖群體進行多年多點的分析和驗證。將定位的與果形指數(shù)相關的QTL位點命名為Fsi3.1，貢獻率為2.8%，根據(jù)毛傳澡和程式華（1999）的研究結(jié)果（貢獻率＜5%為效應微小的QTL，貢獻率＞15%為效應較大的QTL），本試驗所定位的基因?qū)傥⑿Щ?，推測在西瓜果形方面可能存在效應更大的主效QTL或是多個微效QTL，等待進一步發(fā)掘。

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