葉色黃化突變體甜瓜葉片內(nèi)部生理生化變化的研究

邵 勤 于澤源 李興國(guó) 李 為 高艷娟

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

葉色變異是植物界的生命現(xiàn)象之一，其發(fā)生頻率相對(duì)較高，是比較常見(jiàn)的突變性狀。葉色突變體類型豐富，來(lái)源廣泛，形成的原因各不相同。它們是研究植物光合系統(tǒng)、抗病機(jī)制及激素生理等代謝過(guò)程的重要材料（Singh et al.，2000；Agrawal et al.，2001；Fambrini et al.，2004），同時(shí)也是分析鑒定基因功能和創(chuàng)造優(yōu)異種質(zhì)資源的理想材料。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已從擬南芥（Jarvis et al.，1998）、水稻（Wu et al.，2007）、玉米（Yukari & Toshiya，2004）、大麥（Yaronskaya et al.，2003）、小麥（Koval et al.，2001）、油菜（Zhao et al.，2001）、黃瓜（苗晗 等，2010）等作物中發(fā)現(xiàn)、獲得并鑒定出一些葉色突變體。以往對(duì)于甜瓜（Cucumis meloL.）葉色突變體的研究報(bào)道主要著重于葉色突變體的發(fā)生和遺傳規(guī)律等方面（Whitaker，1952），但葉色變異的機(jī)理尚未明確，沒(méi)有對(duì)光合系統(tǒng)的超微結(jié)構(gòu)、葉綠素代謝變化等葉片內(nèi)部生理生化變化進(jìn)行深入研究。

本試驗(yàn)以新發(fā)現(xiàn)的甜瓜葉色黃化突變體9388-1為試材，通過(guò)對(duì)突變體與其突變親本白莎蜜1號(hào)葉綠體超微結(jié)構(gòu)、光合色素含量、葉綠素的生物合成、葉綠素?zé)晒鈪?shù)等方面的比較，對(duì)葉色黃化突變體的生理生化變化進(jìn)行研究，初步明確突變體葉色黃化的生理機(jī)制，為該性狀用于今后的育種實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料正常株系為白莎蜜1號(hào)（農(nóng)家品種），不含葉色突變基因。突變體9388-1是在田間種植白莎蜜1號(hào)時(shí)發(fā)現(xiàn)的自然突變體，經(jīng)過(guò)多年自交發(fā)現(xiàn)其后代葉色性狀不發(fā)生分離，能夠穩(wěn)定遺傳，在表型上與以往報(bào)道的甜瓜葉色突變體不同，整個(gè)生長(zhǎng)周期都表現(xiàn)出該性狀。突變體9388-1除了葉色與白莎蜜1號(hào)有差異外，其他性狀并無(wú)較大差異。由于突變體9388-1葉片的黃化，影響其光合作用，植株生長(zhǎng)比突變親本稍緩慢，但是其他農(nóng)藝性狀均不受影響，生長(zhǎng)發(fā)育正常（圖1）。

2012年3月13日將白莎蜜1號(hào)及其突變體9388-1播種育苗，4月26日定植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站塑料大棚中。試驗(yàn)設(shè)突變親本和突變體兩個(gè)處理，每處理20株，3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，株距30 cm，行距60 cm，兩側(cè)各種保護(hù)行，常規(guī)田間管理。

1.2 方法

1.2.1 光合色素含量的測(cè)定 葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和類胡蘿卜素（Caro）含量按照李合生（2000）的方法并略作修改，用T6紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，含量以mg·g-1（FW）表示。具體步驟如下：

① 5月15日植株處于伸蔓期，各處理隨機(jī)選10株，8：00～9：00取植株頂部向下數(shù)第5片葉，洗凈，用直徑0.5 cm的打孔器取50個(gè)圓片。

圖1 突變體與突變親本葉片顏色

② 隨機(jī)稱取葉片圓片0.2 g，共3份，分別裝入25 mL帶塞的刻度試管中，加入10 mL 80%的丙酮，浸提48 h，至組織發(fā)白。

③ 離心去上清液，用80%的丙酮定容至25 mL，以80%的丙酮為空白對(duì)照，溶液在波長(zhǎng)為663、646 nm和470 nm下進(jìn)行比色，所測(cè)得的吸光度（OD）代入以下公式計(jì)算出溶液中的Chla、Chlb 和 Caro 含量（mg·L-1）：

式中C表示葉綠素濃度。

1.2.2 葉綠素生物合成前體物質(zhì)相對(duì)含量的測(cè)定 利用北京普析通用T6紫外分光光度計(jì)和日立850型熒光分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素生物合成前體物質(zhì)相對(duì)含量，參照徐培洲等（2006）的方法，略有改動(dòng)。取處于伸蔓期（5月15日）的突變體和突變親本植株頂部向下數(shù)第5片葉進(jìn)行測(cè)定。將白莎蜜1號(hào)的各種前體物質(zhì)含量定為100%，與突變體9388-1進(jìn)行比較。

① 5-氨基乙酰丙酸（ALA）的測(cè)定。將0.5 g葉片，用5 mL 4%的三氯乙酸（W/V）及少量石英砂研磨3遍并合并上清液，定容至20 mL，18 000g離心10 min，取上清液5 mL加入2.4 mL的醋酸鈉（1 mol·L-1）和0.15 mL的乙酰丙酮，沸水浴煮10 min后冷卻至室溫，取2 mL加入等體積的顯色液（Ehrlich-Hg試劑：1 g P-二甲胺基苯甲醛溶解于30 mL冰乙酸中，加入8 mL 70%的高氯酸，再用冰乙酸稀釋到50 mL，最后加入0.2 g升汞）黑暗條件下靜置15 min，后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定553 nm處的OD值。

② 膽色素原（PBG）的測(cè)定。將0.5 g葉片用液氮研磨后，加入5 mL提取緩沖液（0.6 mol·L-1Tris，0.1 mol·L-1EDTA，pH 8.2），18 000g離心10 min，取上清液2 mL加入等體積的顯色液黑暗條件下靜置15 min后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定553 nm處的OD值。PBG含量以553 nm的摩爾消光系數(shù)7.2×104mol-1·cm-1計(jì)算。

③ 尿卟啉原Ⅲ（UrogenⅢ）和糞卟啉Ⅲ（CoprogenⅢ）的測(cè)定。1 g葉片用液氮研磨后，加入10 mL的提取緩沖液（0.067 mol·L-1PBS，pH 6.8），18 000g離心10 min，取上清液5 mL加入0.25 mL 1%的硫代硫酸鈉，漩渦振蕩，用強(qiáng)光照射20 min。加入1 mol·L-1的冰乙酸調(diào)整pH至3.5。用10 mL乙醚進(jìn)行萃取，重復(fù)3次，靜置分層后測(cè)定水相在405.5 nm處的OD值，UrogenⅢ含量以405.5 nm的摩爾消光系數(shù)5.48×105mol-1·cm-1計(jì)算；上述乙醚萃取液進(jìn)行合并，再用3 mL 0.1 mol·L-1鹽酸萃取3次，合并后測(cè)定鹽酸相在395.5 nm處的OD值。CoprogenⅢ含量以405.5 nm的摩爾消光系數(shù)4.89×105mol-1·cm-1計(jì)算。

④ 原卟啉Ⅸ（ProtoⅨ）、鎂原卟啉（Mg-Proto）和原脫植基葉綠素酸酯（Pchlide）的測(cè)定。取葉片1 g進(jìn)行冰浴研磨，溶于20 mL丙酮-0.1 mol·L-1氨水（9V：1V）溶液中，用等體積的正己烷萃取該丙酮溶液，靜置10 min，測(cè)定下層丙酮相的熒光發(fā)射強(qiáng)度E400F633、E400F622、E440F595和E440F640。根據(jù)以下公式即可計(jì)算ProtoⅨ和Pchlide的含量。

同時(shí)，鎂原卟啉（Mg-Proto）相對(duì)含量直接以E440F595值表示。

1.2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 采用美國(guó)LI-6400型便攜式光合儀，室外自然條件下，于上午直射光照射葉片前進(jìn)行測(cè)定。隨機(jī)選取處于伸蔓期（5月15日）的突變體9388-1和白莎蜜1號(hào)植株頂部向下數(shù)第5片功能葉片進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)處理測(cè)10株，每株2次重復(fù)，取均值。測(cè)定前，葉片用錫泊紙包裹，進(jìn)行暗適應(yīng)30 min（全部做標(biāo)記）后，按照LI-6400型便攜式光合儀熒光葉室操作說(shuō)明進(jìn)行操作，記錄初始熒光（F0）、最大熒光（Fm）、PSⅡ的實(shí)際利用量子產(chǎn)額（ФPSⅡ）、非環(huán)式電子傳遞速率（ETR）、光化學(xué)猝滅系數(shù)（qP）等熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.2.4 葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察

① 樣品前處理：5月15日，隨機(jī)選取處于伸蔓期的突變體9388-1和突變親本白莎蜜1號(hào)植株各10株，8：00～9：00摘下植株頂部向下數(shù)第5片功能葉片，用去離子水迅速清洗干凈，用濾紙吸干水分，切成1 cm×1 cm的小塊在pH 6.8的2.5%戊二醛溶液中進(jìn)行前固定，并置于4 ℃冰箱中保存。

② 電鏡樣品制備與觀察：前固定期間將其切成1 mm×2 mm小塊，用pH 6.8的磷酸緩沖液沖洗3次，再放入2%四氧化鋨中固定1.5 h。之后用pH 6.8的磷酸緩沖液沖洗3次，用梯度10%的酒精系列脫水，從50%至100%，每級(jí)10 min。經(jīng)過(guò)酒精和丙酮混合液及純丙酮將樣品中的酒精置換成丙酮，再將樣品分別浸入丙酮∶環(huán)氧樹脂812為1∶1和1∶2的混合物中40 min和1.5 h，在純環(huán)氧樹脂812中滲透24 h，然后包埋，在60 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行聚合反應(yīng)。用奧地利Reichert-Jung公司的ULTRACUT-E型超薄切片機(jī)切厚度約為50～70 nm的切片，用帶有支持膜的樣品載網(wǎng)撈起，放入培養(yǎng)皿中，用醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛在25 ℃下分別對(duì)樣品進(jìn)行染色，用雙重蒸餾水沖洗干凈。然后在日本日立公司的H-7650型透射電子顯微鏡下觀察并照相。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)各項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)均3次重復(fù)，用DPS6.5軟件進(jìn)行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)處理及圖表制作用EXCEL。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體與突變親本葉片光合色素含量比較

由表1可以看出，突變體9388-1的光合色素含量都要顯著低于白莎蜜1號(hào)，其中葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的含量分別減少了79.5%、90.3%、81.5%、70.7%，表明該突變體為總?cè)~綠素缺乏突變體，植株黃化是由葉綠素含量降低所導(dǎo)致的。突變體9388-1的葉綠素a/b比值為8.67，顯著高于白莎蜜1號(hào)，說(shuō)明葉綠素a降低幅度小于葉綠素b，葉綠素含量和比例的變化，導(dǎo)致了葉色的黃化。

表1 突變體與突變親本光合色素含量

2.2 突變體與突變親本葉綠素生物合成前體物質(zhì)相對(duì)含量比較

黑暗狀態(tài)下的甜瓜，由于未見(jiàn)光，合成的葉綠素前體物質(zhì)處于積累狀態(tài)。由圖2可以看出，突變體與突變親本的5-氨基乙酰丙酸（ALA）含量差異不明顯，但膽色素原（PBG）含量差異顯著，且突變體的PBG含量顯著高于突變親本，之后突變體的各前體物質(zhì)含量開始下降，且顯著低于突變親本正常株，說(shuō)明突變體9388-1葉綠素合成受阻于膽色素原（PBG）與尿卟啉原Ⅲ（UrogenⅢ）之間。

圖2 突變體與突變親本葉綠素生物合成前體物質(zhì)相對(duì)含量

2.3 突變體與突變親本葉綠素?zé)晒鈪?shù)比較

由表2可以看出，突變體F0、凈光合速率（Pn）、ФPSⅡ和ETR顯著低于突變親本，非光化學(xué)猝滅系數(shù)qN和NPQ顯著高于突變親本，表明這與葉綠素含量降低的趨勢(shì)一致，PSⅡ天線色素吸收光能并用于光合電子傳遞的量子產(chǎn)額和非環(huán)式電子傳遞效率有所降低。突變體Fm、PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率（FV/Fm）和qP與突變親本無(wú)顯著差異，說(shuō)明葉綠素含量在一定范圍內(nèi)的減少不會(huì)顯著影響最大熒光產(chǎn)物，對(duì)光化學(xué)猝滅影響不大且突變體的光化學(xué)效率相對(duì)提高。綜上表明，突變體能及時(shí)地耗散過(guò)剩的光能，對(duì)光合機(jī)構(gòu)起一定的保護(hù)作用，維持正常的光合作用和能量代謝，使突變體能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育。

表2 突變體與突變親本葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù) μmol·m-2·s-1

2.4 突變體與突變親本葉綠體超微結(jié)構(gòu)比較

透射電鏡觀察結(jié)果如圖3所示，突變體9388-1葉綠體內(nèi)部基粒片層垛疊數(shù)有所減少，基粒排列不整齊，呈線條狀；基粒片層間距離大，結(jié)構(gòu)扭曲變形，排列疏松，雙層膜結(jié)構(gòu)不清晰，內(nèi)含物混濁，淀粉粒少；突變親本白莎蜜1號(hào)基粒片層結(jié)構(gòu)有規(guī)律地緊密排列，結(jié)構(gòu)完整，淀粉粒多。說(shuō)明突變體的葉綠體結(jié)構(gòu)比突變親本簡(jiǎn)單，葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育不完整，光合產(chǎn)物的積累相對(duì)較少。

圖3 突變體與突變親本葉綠體超微結(jié)構(gòu)比較

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者已經(jīng)在多種作物中發(fā)現(xiàn)葉色突變體，其利用價(jià)值也越來(lái)越受到關(guān)注。葉色變異的性狀，在苗期可以作為鑒定雜交種純度的有效手段（Zhao et al.，2000）。本試驗(yàn)選用的薄皮甜瓜葉色黃化突變體為自然突變體，其葉色黃化性狀在子葉期就開始表達(dá)，利用這一標(biāo)記性狀能夠最有效地簡(jiǎn)化良種繁育進(jìn)程，同時(shí)也可為甜瓜育種提供優(yōu)良的種質(zhì)資源。

葉色變異常常伴隨著一系列復(fù)雜的代謝過(guò)程。在一定條件下，葉綠素合成代謝、葉綠體發(fā)育等都是多層次、多元化的反應(yīng)。葉色變異與葉綠素含量和葉綠體結(jié)構(gòu)有直接關(guān)系（趙云 等，2003）。葉綠素的生物合成途徑受阻，會(huì)影響葉綠素的合成，從而影響葉綠體的正常發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的光合色素都包埋在類囊體膜中，葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)育缺陷，影響葉綠素及其他光合色素的穩(wěn)定性，最終改變?nèi)~綠體各種色素的含量與比例，最終導(dǎo)致葉色變異（Chen et al.，2005）。不同類型的葉色突變體，光合色素的組成和含量、葉綠素生物合成受阻部位存在差異，葉綠素?zé)晒鈪?shù)和葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)育狀況也各不相同。因此，有必要對(duì)甜瓜葉色突變體光合系統(tǒng)的超微結(jié)構(gòu)、葉綠素代謝變化等葉片內(nèi)部的生理生化指標(biāo)進(jìn)行比較分析。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，突變體9388-1與白莎蜜1號(hào)的光合色素差異明顯，且為總?cè)~綠素缺失型突變體。在葉綠素生物合成過(guò)程中，合成途徑阻礙發(fā)生在膽色素原（PBG）與尿卟啉原Ⅲ（UrogenⅢ）之間，受阻部位與崔海瑞等（2001）對(duì)水稻葉色突變體生物合成特性研究結(jié)果不一致。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)突變體葉綠素的合成受阻、葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)育不良，使葉綠素合成失去了可依托的物質(zhì)基礎(chǔ)，使葉綠素的合成陷于不正常的停滯狀態(tài)，改變了光合色素各成分的含量及比例，最終導(dǎo)致葉色發(fā)生變異。在一定范圍內(nèi)隨葉綠素含量的減少，突變體9388-1光化學(xué)效率有所提高，且能及時(shí)地以熱能的形式耗散光能，對(duì)光合機(jī)構(gòu)起一定的保護(hù)作用，維持正常的光合作用和一系列的生理代謝過(guò)程，這與Xu等（1994）對(duì)大豆葉綠素缺失突變體葉綠素?zé)晒鈪?shù)的分析結(jié)果一致。

隨著甜瓜全基因組測(cè)序的完成，甜瓜葉色突變體的研究已經(jīng)開始進(jìn)入新的模式。本試驗(yàn)結(jié)果從生理水平上揭示了甜瓜突變體葉色黃化的機(jī)理，為今后開展分子生物學(xué)方面的研究奠定了基礎(chǔ)。植物葉色發(fā)生突變的機(jī)制一般是受內(nèi)在和外界環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致基因發(fā)生突變。因此，葉色黃化的內(nèi)外在因素與突變基因之間的關(guān)系還有待于進(jìn)一步深入研究。

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