小菜蛾類鈣粘蛋白片段的原核融合表達(dá)載體構(gòu)建及其條件優(yōu)化

鄭曉旭 楊峰山 朱 勛 張友軍*

（1黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150080 ；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京1 00081）

小菜蛾（Plutella xylostella）屬鱗翅目菜蛾科，是重要的植食性害蟲。該蟲對(duì)多種作物尤其是十字花科蔬菜構(gòu)成嚴(yán)重威脅，嚴(yán)重為害時(shí)能造成作物90%以上的損失，據(jù)全球統(tǒng)計(jì)每年用于防治小菜蛾的費(fèi)用達(dá)40億～50億美元（Talekar＆Shelton，1993；Furlong et al.，2012）。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）可產(chǎn)生多種具有殺蟲活性的晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs），對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲具有較好的殺蟲活性，這些蛋白作為新興的農(nóng)業(yè)害蟲殺蟲劑被廣泛地噴灑或通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入作物中作為抗蟲作物在世界各地廣泛種植，導(dǎo)致許多地區(qū)田間小菜蛾種群產(chǎn)生抗藥性（Schnepf et al.，1998；Fernández et al.，2008；Tabashnik et al.，2011；Vachon et al.，2012）。已經(jīng)逐漸發(fā)現(xiàn)有多種害蟲（草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda、玉米莖夜蛾Busseola fusca、谷實(shí)夜蛾Helicoverpa zea）對(duì)Bt作物產(chǎn)生抗性（Tabashnik et al.，2009），因此如何解決害蟲的抗性問題迫在眉睫。

鈣粘蛋白是鈣離子依賴的跨膜糖蛋白家族的重要成員，普遍存在于脊椎無脊椎動(dòng)物體內(nèi)，在多細(xì)胞有機(jī)體中起著保持細(xì)胞完整性的作用，在細(xì)胞間起連接作用。昆蟲類鈣粘蛋白（Cadherin-like protein）結(jié)構(gòu)與鈣粘蛋白（cadherin）很相似，從N端至C端依次是信號(hào)肽、由9～12個(gè)重復(fù)子（cadherin repeats，CR）組成的重復(fù)區(qū)、近膜區(qū)（membrane proximal extracellular domain，MPED）、跨膜區(qū)（ transmembrane domain ）和胞質(zhì)區(qū)（intracell ular domain）（Xie et al.，2005；Hua et al.，2008）5個(gè)功能區(qū)域。Vadlamudi等（1993）在煙草天蛾Manduca sexta的刷狀緣膜囊（BBMV）上首先發(fā)現(xiàn)類鈣粘蛋白是Bt CrylA類蛋白（Bt菌產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白）的一種受體蛋白。根據(jù)孔隙形成假說，Bt Cry1A毒素首先形成130 kDa大小的前毒素，被昆蟲吞食進(jìn)入中腸內(nèi)，在中腸液的堿性條件下發(fā)生溶解作用，形成60 kDa的活性毒素單體，毒素單體與位于昆蟲中腸上皮細(xì)胞的類鈣粘蛋白表現(xiàn)出高的親活性進(jìn)而水解掉活性毒素的α-1螺旋和N-末端形成促進(jìn)孔隙形成的寡聚物，進(jìn)一步與氨肽酶、堿性磷酸酶等二級(jí)受體結(jié)合導(dǎo)致中腸孔隙形成，細(xì)胞裂解，最終導(dǎo)致昆蟲死亡（Pardo-López et al.，2006；Soberón et al.，2007；Heckel，2012）。昆蟲類鈣粘蛋白靠近近膜區(qū)相鄰的重復(fù)區(qū)域是與Bt Cry1A類殺蟲蛋白結(jié)合并最終形成孔洞的關(guān)鍵區(qū)域，有時(shí)具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。Gómez等（2002）率先利用噬菌體顯示技術(shù)篩選得到了煙草天蛾類鈣粘蛋白（Bt-R1）及家蠶類鈣粘蛋白（Bt-R175）與Cry1A類殺蟲蛋白相結(jié)合的區(qū)域，兩者的氨基酸序列分別為869HITDTNNK876及1296LDETTN1301。進(jìn)一步研究表明煙草天蛾類鈣粘蛋白Bt-R1a至少有3個(gè)與Cry1A類殺蟲蛋白相互作用的部位（Gómez et al.，2002，2003，2006），其中CR12是與殺蟲蛋白相結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，而家蠶類鈣粘蛋白Bt-R175受體與殺蟲蛋白結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域則是CR9（Hua et al.，2004）。Chen等（2007）報(bào)道了煙草天蛾類鈣粘蛋白Bt-R1中含CR12-MPED區(qū)的多肽，可在大腸桿菌中表達(dá)并作為CrylA殺蟲蛋白的增效劑，用于防治鱗翅目幼蟲。隨后也有報(bào)道煙草天蛾類鈣粘蛋白的CR7、CR11也是Cry1A的結(jié)合位點(diǎn)，CR7與 CR11片段也能提高Cry1Ac與Cry1Ab殺蟲蛋白對(duì)煙草天蛾 幼蟲的毒性，但是其增效作用弱于CR12片段。除此之外，CR12片段不僅可以增強(qiáng)Cry1Ab殺蟲蛋白對(duì)煙草天蛾幼蟲的毒殺活性，還對(duì)其他鱗翅目幼蟲也有增效作用（Pacheco et al.，2 009）。隨后岡比亞按蚊Anopheles gambiae（Hua et al.，2008）、玉米根葉甲Diabrotica virgifera（Park et al.，2009）、棉鈴蟲（Peng et al.，2010）、甜菜夜蛾（Lu et al.，2012）等也相繼被報(bào)道包含殺蟲蛋白結(jié)合區(qū)域的類鈣粘蛋白片段，能增強(qiáng)Cry1類殺蟲蛋白對(duì)其幼蟲的殺蟲活性。這些研究結(jié)果充分說明類鈣粘蛋白片段在害蟲防治上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

小菜蛾是一種世界性的農(nóng)業(yè)害蟲，在田間產(chǎn)生抗性多年并且極難治理。如何能夠利用類鈣粘蛋白片段防治小菜蛾是一種新的思路和途徑。因此能夠誘導(dǎo)得到大量高效的小菜蛾類鈣粘蛋白連接區(qū)域片段蛋白是最首要的任務(wù)。本試驗(yàn)通過對(duì)小菜蛾鈣粘蛋白序列的分析，得到了小菜蛾類鈣粘蛋白靠近近膜區(qū)相鄰的重復(fù)區(qū)序列片段PxCad，構(gòu)建了大腸桿菌原核表達(dá)載體，經(jīng)過溫度、時(shí)間、IPTG濃度，以及可溶性分析方面的條件誘導(dǎo)優(yōu)化，最終獲得了大量的類鈣粘蛋白片段融合蛋白，為進(jìn)一步的增效研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

小菜蛾敏感種群（DBM1Ac-S）：2003年由美國康奈爾大學(xué)趙建周教授提供。在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所養(yǎng)蟲室內(nèi)用無蟲甘藍(lán)苗進(jìn)行繼代飼養(yǎng)，期間未接觸任何殺蟲劑。

表達(dá)載體pET28a 由蔬菜有害生物控制與優(yōu)質(zhì)栽培北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，克隆載體pEASY-T5 Zero Cloning Kit和大腸桿菌E.coliBL21（DE3）購自全式金公司，Total RNA提取試劑、mRNA純化試劑盒、1st St rand cDNA、Synthesis Kit、DNA Marker、質(zhì)粒 DNA 提取純化試劑盒、DNA回收試劑盒購自TIANGEN公司，TaqDNA 聚合酶購自TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI，及T4 DNA 連接酶均購自NEB公司，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Thermo公司，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司提供。

引物設(shè)計(jì)：根據(jù) GenBank公布的序列（Accession No.EF541176.1） 及蛋白結(jié)構(gòu)分析，選取靠近近膜區(qū)相鄰的重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，下劃線部分為引入的酶切位點(diǎn)。E-P.xy-cad-F：CGGGATCCCTCACGGAGGCTTTCCA（BamHI酶切位點(diǎn)）；E-P.xy-cad-R：CGGAATTCAGAGGTGTCCGCTAC CAT（EcoRI酶切位點(diǎn)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1PxCad基因的擴(kuò)增和克 隆載體的構(gòu)建 取4齡小菜蛾中腸，利用Trizol試劑提取總RNA；通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增出目的基因。PCR 的反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。利用克隆載體pEASY-T5 Zero Cloning Kit試劑盒構(gòu)建PxCad-T5克隆載體。

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 用BamHI和EcoRI雙酶切上述的PxCad-T5克隆載體和 pET28a原核表達(dá)載體，再分別切膠回收純化。載體和融合片段（PxCad片段）按1∶3比例混合后加入T4 DNA連接酶，16 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21（DE3），挑取陽性克隆抽提質(zhì)粒。并將雙酶切及測序鑒定正確的重組質(zhì)粒，命名為PxCad-pET28a。

1.2.3 PxCad-pET28a/E.coliBL21（DE3）菌生長曲線測定 將種子液（構(gòu)建好的菌株接種到2 mL的LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)好的菌液）按1%的比例接種于200 mL LB（Kna+），37 ℃，180 r·min-1，振搖培養(yǎng)，并開始計(jì)時(shí)。每小時(shí)從三角瓶內(nèi)取2 mL 菌懸液，測定其吸光度OD600值，共測定10 h。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度OD600值為縱坐標(biāo)，作生長曲線圖。

1.2.4 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取陽性單菌落接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃，180 r·min-1，振搖培養(yǎng)過夜。次日，按照1%的比例接入同樣的培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600值約為0.6時(shí)，分別對(duì)融合蛋白表達(dá)的最適IPTG濃度、最佳時(shí)間和最佳溫度進(jìn)行條件誘導(dǎo)，并進(jìn)行不同溫度下融合蛋白可溶性分析。

融合蛋白表達(dá)最適IPTG濃度的誘導(dǎo)：在提前準(zhǔn)備好的OD600值為0.6的菌液中分別加入0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol·L-1和 1.0 mmol·L-1IPTG 在 30℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng) 24 h，以空載體作為對(duì)照，誘導(dǎo)24 h后提取蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳選取最佳的IPTG誘導(dǎo)濃度。

融合蛋白表達(dá)最 佳時(shí)間的誘導(dǎo)：利用篩選的蛋白表達(dá)最適IPTG濃度，在30 ℃，180 r·min-1條件下培養(yǎng)，分別在2、4、8、12、24、36、48 h取樣，提取蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳選取最佳的誘導(dǎo)時(shí)間。

融合蛋白表達(dá)最佳溫度的誘導(dǎo)：利用篩選的最適IPTG濃度和最佳誘導(dǎo)時(shí)間，分別在16、25、30、37 ℃不同溫度下180 r·min-1振搖培養(yǎng)，提取融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳選取最佳的誘導(dǎo)溫度。

不同溫度下融合蛋白的可溶性分析：將上述4個(gè)不同溫度誘導(dǎo)的菌液離心收集菌體，超聲破碎后分為全菌、上清、沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測不同溫度下融合蛋白的表達(dá)及可溶性情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 小菜蛾鈣粘蛋白基因重組載體的構(gòu)建

提取小菜蛾4齡幼蟲中腸RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為實(shí)驗(yàn)用模板。根據(jù)篩選得到的靠近近膜區(qū)相鄰的重復(fù)序列的特異性引物，擴(kuò)展得到小菜蛾鈣粘蛋白基因目的片段。從凝膠電泳（圖1）可見，用特異性引物PCR擴(kuò)增出432 bp大小的目的條帶、pET28a單酶切5 369 bp大小的片段、重組質(zhì)粒單酶切5 801 bp大小的片段、重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI、EcoRI雙酶切切出pET28a和目的片段兩個(gè)大小相符的片段，可以看出抽提的質(zhì)粒包含有正確的酶切位點(diǎn)及預(yù)期插入片段，菌液測序結(jié)果表明插入序列完全與預(yù)期符合，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 生長曲線

生長曲線測定結(jié)果表明，PxCad-pET28a/E.coliBL21（DE3）工程菌在接種1.5 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期（圖2），約2.5 h左右，OD600達(dá)0.6，即為對(duì)數(shù)生長期中期，菌株生長速度快，呈指數(shù)級(jí)生長，新陳代謝活躍，蛋白表達(dá)水平高，所以可選取此時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

在30 ℃，180 r·min-1條件下對(duì)重組菌進(jìn)行IPTG不同濃度誘導(dǎo)表達(dá)24 h，同時(shí)以空載體作為對(duì)照。提取蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳（圖3）可以看出，重組菌體與空載體對(duì)照菌和未誘導(dǎo)菌相比，重組菌出現(xiàn)預(yù)期靶標(biāo)大小相符的目的蛋白條帶（16 kDa），并且在IPTG濃度為0.1 mmol·L-1時(shí)蛋白的表達(dá)量最高，然后隨著IPTG濃度的增高表達(dá)量逐漸降低，并且在1.0 mmol·L-1時(shí)表達(dá)量達(dá)到最低，所以最佳IPTG誘導(dǎo)終濃度為0.1 mmol·L-1。

選取最適IPTG濃度0.1 mmol·L-1對(duì)重組菌在30 ℃、180 r·min-1條件下進(jìn)行不同時(shí)間的誘導(dǎo)表達(dá)，提取蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳（圖4）可以看出，重組菌體與空載體對(duì)照菌和未誘導(dǎo)菌相比，重組菌出現(xiàn)大小相符的目的蛋白條帶（16 kDa），隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，目的蛋白的表達(dá)量逐漸增多，并且在36 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，在48 h時(shí)表達(dá)量又略有下降，因此36 h為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

圖1 小菜蛾P(guān)xCad基因重組載體的構(gòu)建

圖2 融合蛋白PxCad-pET28a/E.coli BL21（DE3）工程菌株的生長曲線

圖3 不同IPTG 濃度對(duì)PxCad-pET28a/E.coli BL21（DE3） 表達(dá)量的影響

分別選取最適的IPTG濃度（0.1 mmol·L-1）和最佳誘導(dǎo)時(shí)間（36 h），在16、25、30、37℃等不同溫度下180 r·min-1振搖培養(yǎng)。提取蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳（圖5）可以看出，目的蛋白（16 kDa）在16 ℃表達(dá)量很低，在25～37 ℃表達(dá)量依次減少，在25 ℃表達(dá)量最高，因此25 ℃為最高表達(dá)量的誘導(dǎo)溫度。

圖4 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)PxCad-pET28a/E.coli BL21（DE3）表達(dá)量的影響

圖5 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)PxCad-pET28a/E.coli BL21（DE3）表達(dá)量的影響

收集以上不同溫度菌體經(jīng)超聲波破碎對(duì)不同溫度表達(dá)的蛋白進(jìn)行可溶性分析，從SDSPAGE電泳結(jié)果（圖6）可以看出，16、25、30、37 ℃下表達(dá)的蛋白均以包涵體的形式存在，由此可見溫度對(duì)蛋白的可溶性并沒有太大的影響。

圖6 PxCad-pET28a/ E.coli BL21（DE3）不同溫度表達(dá)產(chǎn)物可溶性分析

3 結(jié)論與討論

小菜蛾類鈣粘蛋白基因全長5 380 bp，本試驗(yàn)克隆小菜蛾類鈣粘蛋白靠近近膜區(qū)相鄰的重復(fù)區(qū)序列片段基因全長432 bp，獲得與理論值相符的16 kDa的融合蛋白。最佳誘導(dǎo)溫度25 ℃，最佳IPTG誘導(dǎo)終濃度0.1 mmol·L-1，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為36 h，蛋白在16、25、30、37 ℃條件下以包涵體的形式存在。

由于昆蟲中不同種類之間類鈣粘蛋白具有高度同源性（Bel ＆ Escribe，2006）的特點(diǎn)，小菜蛾與其他鱗翅目昆蟲的類鈣粘蛋白一樣，包含5個(gè)基本結(jié)構(gòu)，具有昆蟲鈣粘蛋白典型的結(jié)構(gòu)特征。這種蛋白結(jié)構(gòu)上的保守性說明鱗翅目昆蟲與Bt相關(guān)的類鈣粘蛋白很可能也享有進(jìn)化上的保守功能。已有的結(jié)果表明，昆蟲類鈣粘蛋白的鈣粘蛋白重復(fù)區(qū)域?yàn)樵摰鞍着c殺蟲蛋白結(jié)合的功能區(qū)域，但不同的昆蟲結(jié)合區(qū)域有所差異，多數(shù)為靠近近膜區(qū)的重復(fù)區(qū)域。如棉鈴蟲、棉紅鈴蟲靠近近膜區(qū)的鈣粘蛋白重復(fù)區(qū)域CR10-11是Cry1Ac殺蟲蛋白的結(jié)合區(qū)域，而家蠶Bt-R175受體與殺蟲蛋白結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域則是CR9（Hua et al.，2004；Fabrick ＆Tabashnik，2007）。煙草天蛾 Bt-R1a 受體中CR7、CR11與CR12均為殺蟲蛋白的結(jié)合區(qū)域，但CR12才是與殺蟲蛋白相結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域（Coates et al.，2005）。由于鱗翅目昆蟲類鈣粘蛋白的高度保守性，小菜蛾類鈣粘蛋白與Cry類殺蟲蛋白的結(jié)合區(qū)域很可能也在靠近近膜區(qū)的鈣粘蛋白重復(fù)區(qū)域，這種功能上的保守性有利于闡明Bt Cry類殺蟲蛋白對(duì)小菜蛾的分子機(jī)理以及鱗翅目小菜蛾對(duì)Bt Cry類殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性的機(jī)理。

有文獻(xiàn)報(bào)道棉鈴蟲HaCad片段包含殺蟲蛋白結(jié)合區(qū)域，所表達(dá)的包涵體蛋白能增強(qiáng)Cry1Ac殺蟲蛋白對(duì)棉鈴蟲幼蟲的殺蟲活性（Peng et al.，2009）。然而，也有報(bào)道稱可溶性的棉鈴蟲CR10-11片段降低了Cry1Ac的毒性（Liu et al.，2009）。包涵體類鈣粘蛋白片段與可溶性片段對(duì)Cry類殺蟲蛋白的作用不同，前者對(duì)殺蟲蛋白有增效作用，而后者則表現(xiàn)為減效。這說明昆蟲類鈣粘蛋白對(duì)Bt殺蟲蛋白的增效作用，和昆蟲與殺蟲蛋白種類、類鈣粘蛋白與殺蟲蛋白的質(zhì)量比以及表達(dá)多肽片段的形式密切相關(guān)。因此，表達(dá)時(shí)控制融合蛋白包涵體的含量尤其重要。

原核表達(dá)中外源蛋白表達(dá)量的多少受到多種因素的影響，其中與溫度、誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)濃度的關(guān)系密切相關(guān)。溫度過高或過低表達(dá)量都有所降低，F(xiàn)ass等（1991）研究表明IPTG的劑量有一定范圍，濃度過低影響目的蛋白的表達(dá)，濃度過高則抑制細(xì)菌的生長；誘導(dǎo)時(shí)間也會(huì)對(duì)蛋白表達(dá)量有一定影響，誘導(dǎo)時(shí)間太短，菌體量少，目的蛋白量也少，誘導(dǎo)時(shí)間太長，菌體老化，酶體系統(tǒng)活性減弱，代謝速度減慢，轉(zhuǎn)錄翻譯遲鈍，不利于目的蛋白的表達(dá)。不同的基因由于其固有的特殊性，最優(yōu)的表達(dá)條件也不盡相同，本試驗(yàn)經(jīng)過條件的誘導(dǎo)優(yōu)化，獲取了大量的包涵體融合蛋白，對(duì)于明確其與Bt蛋白的相互作用機(jī)制，以及生產(chǎn)上利用類鈣粘蛋白對(duì)Bt的增效作用的應(yīng)用研究奠定了可行性的基礎(chǔ)。

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